諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制*

蘇福海 全 燦 王海峰 李紅梅

(中國計量科學(xué)研究院，化學(xué)計量與分析科學(xué)研究所，北京 100013)

諾龍(Nandrolone)是蛋白同化雄性類固醇藥物，活性較為顯著[1-3]，既能增強從氨基酸合成蛋白質(zhì)，又能抑制氨基酸分解生成尿素，并有促進體內(nèi)鈣質(zhì)蓄積的功能。其同化作用較其它睪丸素類衍生物強大而持久，而其男性激素作用卻較小。2008年世界反興奮劑機構(gòu)(WADA)公布的《禁用物質(zhì)清單》列舉的蛋白同化制劑主要包括諾龍等9種蛋白同化類固醇類興奮劑[4，5]。目前國內(nèi)還沒有諾龍的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于檢測，因此為了能夠支持動物源性食品中違禁藥物的檢測分析，確保檢測結(jié)果的可靠性、可比性和溯源性[6，7]，筆者研究了諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備。由于一切測量結(jié)果不可避免地具有不確定度[8]，而化學(xué)分析者使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值的準(zhǔn)確性以及不確定度水平是影響分析結(jié)果的一個重要的因素。為此筆者分析了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過程中的不確定度來源[9]，并對不確定度進行了評定。

1 諾龍純品原料定性分析

所需純品原料主要采用市售產(chǎn)品，諾龍(純度大于99%，美國Fluka公司)經(jīng)真空包裝密封儲存在保干器并冷藏于4℃冰箱中，甲醇試劑為色譜純(純度大于99.8%，美國Riedel-de-Haen公司)。

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀:LC-20A型，日本島津公司；

Inertsil ODS-SP色譜柱:250 mm×4.6 mm, 5 μm ，日本GL科學(xué)儀器公司；

紅外光譜儀：AVATAR 330FT-IR型，美國Thermo Nicolet公司。

1.2 液相色譜-質(zhì)聯(lián)法分析

圖1為諾龍的液相色譜-質(zhì)聯(lián)法(LC-MS)譜圖，由圖1可以看出分子離子峰(M+H)+的質(zhì)荷比m/z為275.2，是諾龍分子量(274.4)與氫原子量(1.0)之和，因此可以初步對諾龍定性。

圖1 諾龍原料的LC-MS譜圖

1.3 紅外光譜法分析

諾龍純品原料和諾龍標(biāo)準(zhǔn)的紅外光譜分別如圖2、圖3所示，通過比較圖2和圖3可知，諾龍純品原料紅外光譜圖與諾龍標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜圖一致，可以確認(rèn)純品原料為諾龍。

圖2 諾龍原料純品的紅外光譜圖

圖3 諾龍標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜圖

2 諾龍純品原料純度定值

純品原料中主成分定值方法參照國際上各個國家計量實驗室通用方法。高純有機化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值方案，國外最早形成于20世紀(jì)70年代，對純度為99%以上的化合物，通常選擇高效液相色譜(HPLC)歸一化法對其純度進行定值[10-12]。因此采用多家實驗室聯(lián)合定值的方法，共有7家實驗室參與，每家實驗室發(fā)放7瓶樣品，其中1瓶提供7個純度值，其余6瓶各給出3個純度值。選擇以下色譜條件：流動相為水(含0.1% HAc)-乙腈(體積比為50∶50)等度洗脫，流速為1.0 mL/min；色譜柱：Inertsil ODS-SP柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；進樣量：5 μL(1.00 mg/mL的諾龍甲醇溶液)；監(jiān)測波長：220、230、235、242、250、260 nm；定值波長：242 nm。

表1 諾龍純度多家合作定值結(jié)果 %

對表1數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計檢驗，結(jié)果列于表2。

表2 統(tǒng)計檢驗結(jié)果

3 諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是采用重量法精確制備，方法如下：使用經(jīng)過檢定合格的分析天平(分度0.1 mg)準(zhǔn)確稱量經(jīng)過純度分析的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料純品300～500 mg,轉(zhuǎn)移溶質(zhì)于準(zhǔn)確稱重過的潔凈錐形瓶中。在另一個分析天平(分度0.01 g)，加入一定質(zhì)量的甲醇至錐形瓶中，所需的甲醇質(zhì)量根據(jù)甲醇的密度0.791 g/mL和擬配制的諾龍體積濃度計算得出。精確稱量所加入甲醇的質(zhì)量，充分混勻，制得諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，濃度為1.00 mg/mL。

利用重量法配制了200瓶以上濃度為1.00 mg/mL的諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用液相色譜法對所配制溶液進行核驗，核驗結(jié)果列于表3。

表3 甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

注：甲醇密度 (20℃) 為0.791 g/mL。

4 諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗

根據(jù)JJG 1006-1994《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》的要求對研制的溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行均勻性檢驗。具體抽樣檢驗方法為：從每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機抽取11瓶，進行瓶間均勻性檢驗；再取任意一瓶，取7個子樣，進行瓶內(nèi)均勻性檢驗(采用HPLC法測定)，檢驗結(jié)果見表4。對表4數(shù)據(jù)進行F檢驗和t檢驗，證明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)瓶內(nèi)和瓶間樣品均勻一致[13]。

表4 諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗結(jié)果

5 諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性檢驗

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性考察按先密后疏的原則，在一定時間間隔內(nèi)選擇定值方法即液相色譜法，檢測在規(guī)定條件下保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度隨時間的變化情況，通常分別在第1、2、3、6個月進行穩(wěn)定性監(jiān)測。每次取5個包裝，每個包裝取一個子樣，檢測3次，計算平均值，把5個包裝測量結(jié)果平均值作為檢測結(jié)果，檢驗結(jié)果列于表5。實驗證明諾龍溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在監(jiān)測期間內(nèi)是穩(wěn)定的。

表5 諾龍溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性考察

6 諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值不確定度評定

6.1 液相色譜法純度定值引入的不確定度

(1)液相色譜法定值測量重復(fù)性引入的不確定度u1=0.01%；

(2)各組分在不同檢測波長下響應(yīng)差異引入的不確定度u2

綜合考慮主成分和雜質(zhì)化合物在相應(yīng)檢測波長下的響應(yīng)，各組分引入的不確定度u2-i采用以下公式進行量化：

純度定值標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

uLC,rel=0.03%/99.64%=0.03%

6.2 合作定值結(jié)果的不確定度

液相色譜合作定值產(chǎn)生的不確定度列于表6。

表6 液相色譜法合作定值結(jié)果不確定度

根據(jù)表5，u多家，rel=0.07%/99.64%=0.07%

6.3 溶液制備過程引入的不確定度

(1)天平稱量引入不確定度

天平稱量不確定度主要來源于天平稱量最大允許誤差、天平稱量變動性、浮力影響 (在常規(guī)狀態(tài)下稱重，此項可忽略)。

純品原料稱量使用0.1 mg分度的分析天平，天平的變動性、檢定誤差等估計為0.05 mg，稱樣量為400 mg，按矩形分布，相對不確定度為0.007%。

甲醇的稱量使用0.01 g分度的分析天平，天平的變動性、檢定誤差等估計為0.01 g，稱樣量為300 g，按矩形分布，相對不確定度為0.002%。

(2)溫度對體積的影響引入的不確定度

因此，諾龍溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制引入的相對不確定度為：

6.4 諾龍甲醇溶液核驗引入的不確定度

利用重量法配制了濃度為1.00 mg/mL的諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用液相色譜法對所配制溶液進行了核驗，以其7次重復(fù)測量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD計入結(jié)果不確定度評定中，經(jīng)計算,u核驗,rel=0.14%。

6.5 合成相對不確定度

取k=2,則相對擴展不確定度為:

U=0.38%×2≈1.0 %

諾龍溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為1.00 mg/mL時，相對擴展不確定度為1.0% (k=2)。

7 結(jié)語

采用紅外光譜、質(zhì)譜法對純度大于99%的諾龍市售產(chǎn)品經(jīng)定性分析后，利用HPLC面積歸一化方法對諾龍原料純度進行定值；利用重量法配制濃度為1.00 mg/mL的諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并進行了均勻性、穩(wěn)定性檢測；對濃度定值結(jié)果進行了不確定評定。所研制的諾龍溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對于保證檢測實驗室測量結(jié)果的準(zhǔn)確可靠與互認(rèn)、避免在食品檢測中出現(xiàn)“測不準(zhǔn)”問題具有重要意義。

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