廣州地區(qū)健康兒童腸道病毒71型抗體水平調(diào)查

鄺 璐 王長兵 梁卓夫 鐘家禹 肖密絲 朱 冰

1995年，中國首次從手足口病(HFMD)患者分離出腸道病毒71型(EV71)，至2008年全國范圍內(nèi)數(shù)次出現(xiàn)EV71導(dǎo)致的HFMD暴發(fā)疫情，并有死亡病例的報道。因此，中國衛(wèi)生部于2008年5月將其列為丙類傳染病[1]。EV71感染人體后，首先在體內(nèi)產(chǎn)生IgM抗體，其在體內(nèi)持續(xù)的時間較短，隨后會產(chǎn)生IgG抗體，該抗體可在體內(nèi)存在較長時間。IgG抗體可產(chǎn)生對同型病毒的持久免疫，檢測血清中EV71-IgG抗體能夠反映該病毒在人群中的流行特征和個體既往感染情況。因此抗體檢測對于了解EV71的傳播特征具有重要的意義。國內(nèi)外在EV71病原學(xué)和分子生物學(xué)方面已有深入研究，但對EV71抗體水平調(diào)查尚無詳細(xì)的研究報道。本研究擬通過檢測健康兒童血清EV71-IgG抗體水平，以了解廣州地區(qū)不同年齡健康兒童EV71-IgG抗體陽性率的情況，并分析與EV71感染HFMD發(fā)病的關(guān)系。

1 方法

1.1 EV71的來源與分型 來源于本實驗室從HFMD患兒分離到的標(biāo)本，參照GenBank上EV71基因組設(shè)計分段擴增引物，進行RT-PCR分段擴增EV71基因組，PCR產(chǎn)物直接進行序列測定，采用ClustalW/X、DNASTAR、MEGA 4.1等軟件分析基因組序列，構(gòu)建EV71的全基因組進化樹后，顯示與C4亞型的分離株明顯分在一組(另文待發(fā)表)，因此本研究分離到的EV71株為C4亞型。

1.2 EV71 C4型IgG抗體檢測方法的建立

1.2.1 EV71診斷抗原制備 ①RD細(xì)胞(購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%時，接種EV71，當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)達到75%后收獲(2～3 d)，將細(xì)胞培養(yǎng)的病毒反復(fù)凍融3次；②將凍融后的病毒在4℃、12 000g離心1 h，去除細(xì)胞碎片；上清再經(jīng)過0.22 μm過濾器過濾，保存濾液；③病毒濾液36 000g離心，收集沉淀物，沉淀物用10 mmol·L-1PBS溶解；④采用連續(xù)密度梯度法純化病毒，用氯化銫調(diào)比重至重量體積比為1.34 g·mL-1，38 000g離心24 h，收集蛋白條帶。蛋白條帶用10 mmol·L-1PBS稀釋10倍，38 000g離心4 h，再用10 mmol·L-1PBS溶解沉淀物，即為EV71純化物；⑤病毒鑒定：將EV71純化物用磷鎢酸進行染色，銅網(wǎng)固定后在電鏡下進行觀察。

1.2.2 EV71-IgG抗體診斷試劑盒建立方法

1.2.2.1 試劑盒生產(chǎn)工藝 ①抗體微孔板制備：包被緩沖液選擇50 mmol·L-1(pH 9.6)碳酸鈉緩沖液，EV71純化物稀釋為5 μg·mL-1，每孔加入100 μL包被酶標(biāo)板，4℃過夜。取出后甩干，10 mmol·L-1PBS洗滌1遍，每孔加入封閉液[1%牛血清白蛋白(BSA)，5%NBS，3%蔗糖，10 mmol·L-1PBS等]150 μL，置4℃冰箱中過夜。直接甩掉封閉液，37℃烘干2 h，封板4℃保存?zhèn)溆?。②羊抗人IgG辣根過氧化物酶(Sigma公司)，用酶標(biāo)稀釋液[1%BSA、0.5%明膠、0.1%酪蛋白、0.1% 氨基比林、0.1% Proclin-300、10 mmol·L-1PBS(pH 7.2)]將抗體酶稀釋至工作濃度，分裝至酶標(biāo)瓶中。③抗體稀釋液配制：配方為0.5%BSA、10 mmol·L-1PBS和0.1% Proclin-300，分裝到瓶中。④顯色液、終止液配制：顯色液A配方為0.005%雙氧水和0.1 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH 5.0)，顯色液B配方為2.5 mg·L-1四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和無水乙醇。終止液為2 mol·L-1硫酸。

1.2.2.2 試劑盒檢測方法 采用ELISA間接法檢測EV71-IgG抗體。在微孔條上包被純化的EV71抗原，檢測時將待檢血清樣本用血清樣本稀釋液1∶100進行稀釋，吸取100 μL稀釋物加入微孔條中，37℃溫育30 min，洗板5遍后加入羊抗人IgG辣根過氧化物酶工作液100 μL，37℃溫育30 min，洗板5遍后加入底物A和B各50 μL，37℃顯色10 min，加入終止液50 μL，用酶標(biāo)儀450 nm/630 nm雙波長讀值判定結(jié)果。

1.2.2.3 試劑盒臨界值判斷 采用細(xì)胞中和實驗方法[2]，篩選出150份EV71-IgG抗體陰性血清，采用本試劑盒檢測，繪制ROC曲線，以YOUDEN指數(shù)最大所對應(yīng)的A值作為臨界值。

1.2.2.4 試劑盒實驗室評價 采用細(xì)胞中和實驗方法，篩選出EV71陽性血清20份、EV71陰性血清100份、柯薩奇A16病毒抗體陽性血清5份。用本試劑盒檢測上述血清。

1.3 健康兒童血清EV71-IgG抗體分析 收集2010年1～3月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心(我院)兒?？瞥檠M行常規(guī)保健檢測的剩余血清標(biāo)本，篩選出無發(fā)熱、無HFMD癥狀的健康兒童血清標(biāo)本，-20℃保存?zhèn)溆?。采用EV71-IgG抗體診斷試劑盒檢測血清標(biāo)本，結(jié)果以陽性和陰性表示。

1.4 HFMD患兒EV71檢測 對符合衛(wèi)生部《手足口病診療指南2010年版》確診的我院2010年全年門診及住院HFMD患兒，取患兒咽拭子標(biāo)本采用實時熒光PCR檢測方法[3]進行EV71特異性核酸檢測。

1.5 分組 健康兒童和HFMD患兒均分別依年齡分為<1歲、～2歲、～3歲、～4歲、～5歲和～14歲組。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 EV71-IgG陽性率的年齡和性別差異采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 EV71純化物電鏡分析 EV71顆粒直徑約為26 nm(圖1)，與文獻[4]描述一致。

圖1 EV71純化物電鏡圖片

Fig 1 Photo of purified EV71 virus under electron microscope

2.2 EV71-IgG試劑盒臨界值確定 以150份EV71-IgG抗體陰性血清的A值繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，本研究設(shè)定的臨界值為0.148。血清樣本A值≥0.148判為EV71-IgG抗體陽性，<0.148則判為陰性。

2.3 EV71-IgG試劑盒實驗室評價 結(jié)果顯示，本研究建立的試劑盒可檢測出陽性血清20份，與細(xì)胞中和實驗方法陽性符合率為100%；可檢測出陰性血清92份，與細(xì)胞中和實驗方法陰性符合率為92%；與柯薩奇 A16病毒抗體無交叉反應(yīng)。

2.4 健康兒童不同年齡和性別血清EV71-IgG陽性率比較 2010年1～3月獲得819名健康兒童血清標(biāo)本，其中男481名，女338名。表1所示，<1歲組EV71-IgG抗體陽性率最高，此后逐漸下降并維持在較低水平。各年齡組EV71-IgG抗體陽性率兩兩比較顯示，<1歲組EV71-IgG抗體陽性率顯著高于其他各組(均P<0.05)；～2歲組EV71-IgG抗體陽性率顯著高于～3歲、～4歲、～5歲和～14歲組(均P<0.05)?！?歲，～4歲，～5歲和～14歲組EV71-IgG陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。各年齡組EV71-IgG抗體陽性率未見顯著性別差異(P>0.05)。

2.5 HFMD患兒EV71檢測結(jié)果 2010年我院確診病例EV71特異性核酸檢測陽性HFMD患兒的咽拭子標(biāo)本4 780例，其中男3 070例，女1 718例。 EV71陽性率各年齡組分布，<1歲310例(6.5%)，～2歲1 157例，(24.2%)～3歲1 337例(28.0%)，～4歲1 094例(22.9%)，～5歲450例(9.4%)，～14歲432例(9.0%)。

表1 819名健康兒童各年齡組血清EV71-IgG陽性率(n/N)

Tab 1 Positive rate of EV71-IgG in different age groups in 819 normal children

Agegroup/yPositivemales/totalmalesPositivefemales/totalfemalesPositive[n(%)]<1(n=100)31/5729/4360(60.0)-2(n=183)42/10630/7772(39.3)-3(n=116)11/684/4815(12.9)-4(n=140)27/9111/4938(27.1)-5(n=113)9/647/4916(14.2)-14(n=167)25/9513/7238(22.8)

Notesχ2test analysis showed that in age group 0 to 1 EV71-IgG positive rate was significantly higher than other groups (χ2was 11.65, 52.49, 26.07, 48.58 and 37.35, respectively,P<0.05); among the age groups of 2 to 3 years old, 3 to 4 years old, 4 to 5 years, and 5 to 14 years old, the EV71-IgG positive rate's differences were not statistically significant. The binomial distribution analysis showed that there was no gender difference in the positive rate of all age groups between the six age groups (P> 0.05)

2.6 健康兒童血清EV71-IgG抗體陽性率與EV71陽性年齡構(gòu)成比的相關(guān)性趨勢 圖2所示，3歲前EV71-IgG抗體陽性率與EV71陽性年齡構(gòu)成比呈相反趨勢，4～14歲呈相同趨勢。<1歲組EV71-IgG抗體陽性率最高，而EV71陽性年齡構(gòu)成比最低；～3歲組EV71-IgG抗體陽性率最低，而EV71陽性年齡構(gòu)成比最高。

圖2 健康兒童各年齡組血清EV71-IgG陽性率與EV71陽性年齡構(gòu)成比相關(guān)性

Fig 2 The relationship between EV71-IgG positive rates and EV71 positive rates in different age groups in healthy children

3 討論

自從2008年3月中國安徽省暴發(fā)HFMD疫情以來，全國各地都出現(xiàn)HFMD的暴發(fā)流行[5～7]。2008年，廣州地區(qū)HFMD的主要病原是EV71(63.6%)[3]。由于EV71引起的HFMD會進一步發(fā)展為無菌性腦膜炎、重癥腦膜炎，甚至死亡。因此對EV71的研究受到國內(nèi)外學(xué)者的重點關(guān)注[8～10]。本實驗中用于包被的病毒抗原為臨床分離，經(jīng)過基因測序為EV71 C4亞型，這與中國疾病預(yù)防控制中心2008年5月發(fā)布的中國EV71流行的亞型相同。本實驗采用純化全病毒作為抗原包被建立ELISA間接法檢測血清中的EV71-IgG，可提高檢測的敏感度和特異度。該抗原保留了天然抗原所具備的抗體結(jié)合特性，所有的抗原決定簇包括立體構(gòu)型決定簇都不會受到破壞，保證了反應(yīng)的特異性。本實驗與細(xì)胞中和實驗方法陽性符合率為100%，陰性符合率為92%，與柯薩奇 A16病毒抗體無交叉反應(yīng)。提示，本研究建立的試劑盒基本可應(yīng)用于健康兒童血清EV71-IgG抗體分析。

通過對健康兒童各年齡組血清EV71-IgG抗體陽性率比較，結(jié)果顯示～1歲組血清EV71-IgG抗體陽性率顯著高于其他各年齡組，考慮該年齡組與外界接觸機會較少，提示較高的EV71-IgG抗體可能來自于母體[10]；之后抗體陽性率呈下降趨勢，提示母傳途徑獲得的EV71-IgG抗體逐漸消失。

本研究還對2010年確診EV71感染的HFMD患兒進行分析，結(jié)果顯示，<1歲EV71陽性年齡構(gòu)成比最低(6.5%)，而EV71-IgG陽性率最高(60.0%)，提示EV71-IgG母傳抗體可能對HFMD的發(fā)病保護作用強；～2歲組EV71陽性年齡構(gòu)成比39.3%，同年齡組EV71-IgG陽性率24.2%逐漸接近，～3歲組和～4歲組EV71陽性年齡構(gòu)成比處于較高水平(22.9%和28.0%)，提示為HFMD的高峰年齡，而該年齡組的EV71-IgG抗體陽性率處于較低水平(12.9%和27.1%)，提示缺少EV71-IgG抗體的保護，可能是導(dǎo)致HFMD高發(fā)的原因之一。

綜上表明，5歲以下的兒童是感染EV71的主要人群,而且該年齡組的兒童大多與外界有密切接觸，集中在托幼機構(gòu)，EV71極易通過日常接觸、玩具和其他教學(xué)用具傳播。因此該年齡組的兒童是EV71防控的重點對象。目前在沒有特效治療HFMD的藥物和預(yù)防EV71的疫苗時，應(yīng)根據(jù)EV71的流行特點進行防控，要點是控制傳染源，切斷傳播途徑。此外，加強EV71疫苗的研制，以提高1～5歲EV71易感人群的保護性抗體水平是目前亟待解決的問題。

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