血脈通2號顆粒對血管內(nèi)皮細(xì)胞 MMPs及其相關(guān)因子的研究*

斌霞 奕民 江蘇省常州市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科(常州 213003）

血脈通2號顆粒對血管內(nèi)皮細(xì)胞 MMPs及其相關(guān)因子的研究*

張琪張斌霞張奕民王紫逸江蘇省常州市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科(常州 213003）

目的:觀察血脈通 2號顆粒對血管內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs）及其相關(guān)因子的影響。方法:通過體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞,血脈通 2號顆粒含藥血清干預(yù),采用血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT）檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞活性,酶聯(lián)免疫雙抗夾心法測定 MMPs及其相關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)果:血脈通 2號可增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性,降低轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β）、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(EMMPRIN）的水平,對基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)呈劑量相關(guān)性抑制作用。結(jié)論:血脈通 2號可增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性,在體外可影響 MMPs相關(guān)因子的表達(dá),進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶,具有穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用。

血脈通 2號顆粒是江蘇省名中醫(yī)張琪用于治療動(dòng)脈粥樣硬化的系列經(jīng)驗(yàn)方之一,已制成院內(nèi)制劑,臨證收到良好療效,為進(jìn)一步探討其作用機(jī)理,我們進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究,報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料1.1 細(xì)胞、藥物及試劑 VEC(人血管內(nèi)皮細(xì)胞）購自上海細(xì)胞所,96孔板 (美國 COSTOR公司）DMEM(美國 GBICO公司 ）,小牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品）,胰蛋白酶(Typrin,1:250,Amerso,USA）,溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT上海伯奧生物科技公司）,二甲基亞砜(廣東光華化學(xué)廠有限公司 ）,血脈通 2號顆粒,為常州市中醫(yī)院自制制劑(成分為生首烏、黃芪、僵蠶、水蛭、赤芍、川芎,主要用于頸動(dòng)脈粥樣硬化的治療）每 1g顆粒相當(dāng)于 4.09g生藥,由江蘇天江藥業(yè)有限公司提供。洛伐他汀(批號 080902,山東羅欣藥業(yè)股份有限公司）。

1.2 儀器 倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS公司產(chǎn)品）,5% CO2培養(yǎng)箱 (USA）,酶標(biāo)儀(國營華東電子管廠）,離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠）,電熱恒溫水溫箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）;超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 含藥血清的制備 取大鼠 15只,隨機(jī)分為 5組,每組 3只,給藥前禁食 12h,不禁水。各組大鼠每日給藥 1次,連續(xù)給藥 7d。最后一次給藥后 2h,大鼠頸動(dòng)脈取血,分離血清。同組血清合并,56℃水浴滅活 30min,用 0.122um的微孔濾膜過濾除菌,置-20℃保存?zhèn)溆??？瞻讓φ战M,給予等容積生理鹽水;陽性對照組,給予洛伐他汀 6.67mg/kg;血脈通低、中、高劑量組,分別給予血脈通顆粒 7.5g/kg,15g/kg,30g/kg。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 2.2.1復(fù)蘇與傳代:取出貯存細(xì)胞 ,37℃水浴中快速融化。把 1～ 2mL凍存細(xì)胞的混合物加入到大約10mL完全生長培養(yǎng)基中,輕輕混勻。 500～ 1000轉(zhuǎn)離心 5min。棄去上清。接種于含 8%胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、4mmol/L谷氨酰胺、1mol/LHEPES的 HGDMEM培養(yǎng)液中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞接種應(yīng)該至少為 603× 105活細(xì)胞 /mL。當(dāng)細(xì)胞生長至單層致密狀時(shí),用 0.25%胰蛋白酶消化后以 1:3傳代,24h換液,72h再次傳代。

2.2.2 細(xì)胞分組:陰性對照組:每孔加入 160uL細(xì)胞懸液,共 8孔;30min后 ,每孔均加入 40uL培養(yǎng)液;H2O2(100umol/L）模型組:每孔加入 160uL細(xì)胞懸液,共 8孔,每孔均加入20uL100umol/LH2O2,30min后,加入 20uL培養(yǎng)液;空白組:每孔加入 160uL細(xì)胞懸液,共 8孔 ,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后,再加空白血清;陽性組:每孔加入 160uL細(xì)胞懸液,共 8孔,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后,再加 20uL陽性組的含藥血清;低劑量組:每孔加入 160uL細(xì)胞懸液,共 8孔,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后,再加 20uL低劑量組的含藥血清;中劑量組:每孔加入 160uL細(xì)胞懸液,共 8孔,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后,再加 20uL中劑量組的含藥血清;高劑量組:每孔加入160uL細(xì)胞懸液,共 8孔,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后 ,再加 20uL高低劑量組的含藥血清。

2.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT） 將血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,加入 DMEM培養(yǎng)液于 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每 2天傳代 1次,傳代時(shí)用 0.25%胰蛋白酶消化2min。

取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞,加入適量 0.25%胰蛋白酶消化2min。用含 10%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液 ,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,以培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞,使之配成 2×105/mL細(xì)胞懸液,加入 96孔板。使給藥組每孔含細(xì)胞懸液 160μL,藥液占 20μL,生理鹽水 20μL,對照組含細(xì)胞懸液 160μL,生理鹽水 40μL。在 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 24h。 24h后每孔加入20μL5mg/mLMTT溶液,37℃溫育 4h,吸出 上清液,加入100μLDMSO,混勻后用酶標(biāo)儀在 490nm處 ,測定每孔 OD值。

2.4 血管內(nèi)皮細(xì)胞 MMPs及其相關(guān)因子的蛋白表達(dá)檢測 用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法測定,按照各試劑盒說明進(jìn)行操作。

4 結(jié)果 4.1 不同濃度血脈通 2號對 H2O2損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響作用 見表 1,血管內(nèi)皮細(xì)胞活性與細(xì)胞陰性對照組相比 H2O2損傷模型組明顯下降,而經(jīng)含藥血清作用,低、中、高劑量組和陽性組的細(xì)胞活性均有不同程度增加,與模型組對比,有顯著性差異,血脈通與陽性組組間比較提示血脈通 2號中劑量組與陽性組增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞活性作用相當(dāng),而低、高劑量組與陽性組有組間差異,陽性組作用優(yōu)于低、高劑量組。22

表1 血脈通 2號對 HO損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響作用(±s）

表1 血脈通 2號對 HO損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響作用(±s）

組 別 H2O2模型組 空加 H2O2 陽性組 低劑量組 中劑量組 高劑量組 空白不加 H2O2 陰性對照組細(xì)胞活性 0.33± 0.06◇ 0.77± 0.03▲△ 0.86± 0.05▲ 0.75± 0.09▲◆ 0.83± 0.06▲ 0.95±0.04▲◆ 1.02± 0.05◇▲ 0.83±0.02▲

注:與空白不加 H2O2對比,△P＜0.01;與模型組對比,▲ P＜0.01;與細(xì)胞陰性對照組對比,◇ P＜0.01;與陽性組對比,◆ P＜0.01。

4.2 對血管內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及其相關(guān)因子的影響 見表 2,模型組和空白組 MMP-2、TGF-β、EMMPRIN發(fā)生了明顯的變化,較陰性對照組有顯著性差異,經(jīng)含藥血清干預(yù)后,與模型組相比血脈通 2號高劑量組和陽性組 MMP-2降低有顯著性差異,與空白組相比血脈通 2號高劑量組和陽性組MMP-2降低也出現(xiàn)了顯著性差異,血脈通高劑量組與陽性組組間比較無差異,提示這兩組在降低 MMP-2方面作用相當(dāng);與模型組相比血脈通 2號中、高劑量組和陽性組降低 TGF-β出現(xiàn)了顯著性差異,與空白組相比血脈通各劑量組和陽性組降低TGF-β也出現(xiàn)了顯著性差異,血脈通各劑量組與陽性組組間比較無差異,提示在降低 TGF-β方面血脈通各劑量組與陽性組作用相當(dāng);與模型組相比血脈通 2號各劑量組和陽性組降低EMMPRIN出現(xiàn)了顯著性差異,與空白組相比血脈通 2號各劑量組和陽性組降低 EMMPRIN也出現(xiàn)了顯著性差異,血脈通高劑量組與陽性組組間比較無差異,提示在降低 EMMPRIN方面血脈通高劑量組與陽性組作用相當(dāng),而血脈通低、中劑量組與陽性組組間比較有差異,提示陽性組作用優(yōu)于低、中劑量組。

表2 血脈通 2號對血管內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及其相關(guān)因子表達(dá)的影響(±s）

表2 血脈通 2號對血管內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及其相關(guān)因子表達(dá)的影響(±s）

注:與正常組對比△ P＜0.05,▲P＜0.01;與模型組比較◇P＜0.05,◆P＜0.01;與空白組比較□ P＜0.05,■P＜0.01;與陽性組比較○ P＜0.05,● P＜0.01。

組 別 孔 數(shù) 給藥劑量(mL） MMP-2(ng/mL） TGF-β(pg/mL） EMMPRIN(pg/mL）陰性組 8 0.5 2.98± 0.86 51.50± 10.49 15.09± 4.81空白組 8 0.59.26± 2.23▲ 105.70± 12.43▲ 139.11± 2.94▲模型組 8 0.59.33± 0.56▲ 102.53±2.06▲ 143.09± 4.70▲陽性組 8 0.55.51± 1.96◆△■ 74.41±15.07◆▲■ 30.22±4.47◆■▲低劑量組 8 0.57.75±1.99▲○ 88.73±13.79▲○ 43.97± 1.87◆▲■●中劑量組 8 0.57.64±0.82▲○ 86.49±7.33◇▲□ 36.98± 9.09◆▲■○高劑量組 8 0.55.75± 1.02◆▲■ 81.79±14.33◆▲■ 30.59±2.32◆▲■

5 討 論 血管內(nèi)皮細(xì)胞處于血液和血管壁組織之間,易受多種因素的損傷。研究證明,血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙是許多血管病變的始動(dòng)因素,與冠心病、高血壓等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞,用 H2O2損傷,血脈通 2號含藥血清干預(yù),觀察對內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的直接作用及對 H2O2所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn),血脈通 2號可以增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性,用于血管內(nèi)皮損傷的修復(fù),對 H2O2所致的內(nèi)皮增殖活性的抑制具有良好的保護(hù)作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān),其表達(dá)受到一些調(diào)控因子的影響。其中細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子 (extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer,EMMPRIN）是 MMPs的主要調(diào)節(jié)因子,EMMPRIN不僅誘導(dǎo)MMPs的產(chǎn)生而且與多種細(xì)胞及細(xì)胞因子相互作用參與 AS的發(fā)生發(fā)展過程。EMMPRIN通過自分泌和旁分泌途徑,誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶[1,2]。EMMPRIN在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞以及人類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)高表達(dá)[3～5],在富含平滑肌細(xì)胞的頸動(dòng)脈斑塊中低度糖基化的 EMMPRIN含量很高并與 MMP-2表達(dá)呈正相關(guān),而在富含巨噬細(xì)胞的斑塊中多為高度糖基化的 EMMPRIN并與MMP-9表達(dá)量呈正相關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),血脈通 2號低、中、高劑量組的 EMMPRIN與模型組和空白組相比均出現(xiàn)了有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異,與 MMP-2下降呈直線相關(guān)。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β）通過對 MMPs和 TIMPs家族成員因細(xì)胞類型而異的基因表達(dá)調(diào)控作用,表現(xiàn)出調(diào)節(jié) ECM重建的生物學(xué)效應(yīng)[6]。TGF-β可通過激活 Smad通路、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK）通路,以及刺激激活蛋白-1(AP-1）復(fù)合體的形成,完成對 MMPs和 TIMPs基因表達(dá)的調(diào)控功能。目前未見 TGF-β對血管內(nèi)皮細(xì)胞 MMPs和 TIMPs調(diào)控的報(bào)道,本課題在觀察 MMP-2表達(dá)的同時(shí),檢測 TGF-β在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,血脈通 2號中高劑量組和陽性組TGF-β、MMP-2表達(dá)水平下降,與模型組相比有顯著性意義,兩者均呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。

血脈通 2號顆粒以“補(bǔ)腎益精、泄?jié)峄觥睘閯t立方,是治療動(dòng)脈粥樣硬化的經(jīng)驗(yàn)方。本實(shí)驗(yàn)觀察到該方對影響 MMP-2分泌的 EMMPRIN、TGF-β產(chǎn)生了抑制作用,對 MMP-2在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)有抑制作用,推測是通過影響其相關(guān)因子進(jìn)而抑制 MMP-2的表達(dá),此為中藥復(fù)方制劑的綜合作用,具體是復(fù)方中什么藥物或成分有抑制 MMP-2的作用,目前尚未見相關(guān)報(bào)道,須進(jìn)一步研究以明確。

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血脈通 /藥效學(xué) 大鼠 實(shí)驗(yàn)研究

R28

A

1000-7369(2011）01-0101-03

*江蘇省常州市科技局基金項(xiàng)目(CS20092026）

(收稿 2010-07-30;修回 2010-09-01）