血啉甲醚對(duì)單增李斯特菌的光動(dòng)力滅活作用及機(jī)理＊

林少玲,唐書澤,唐姝姝,吳希陽,陳振強(qiáng)

光動(dòng)力技術(shù)是指生物組織中的光敏物質(zhì)受到相應(yīng)波長光照后,吸收光子能量,由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),并迅速退激釋放能量而返回基態(tài)的過程。該過程能夠生成大量活性氧,活性氧與多種生物大分子相互作用,從而損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)或影響細(xì)胞功能[1-2]。在醫(yī)學(xué)上,利用光動(dòng)力反應(yīng)進(jìn)行疾病診斷和治療的技術(shù)稱之為光動(dòng)力療法 (photodynamic therapy,PDT),目前主要用于惡性腫瘤和皮膚癌的治療[3],在血液制品消毒等方面的作用也得到了廣泛認(rèn)同,其安全性也得到了較為詳盡的論證[4-5]。

光動(dòng)力滅菌技術(shù) (anti-microbial photodynamic technology,APDT)是在光動(dòng)力技術(shù)的基礎(chǔ)上,利用光敏劑對(duì)細(xì)菌的優(yōu)先聚集特性,在適當(dāng)波長的光激發(fā)下,使光敏劑吸收能量后產(chǎn)生單線態(tài)氧、自由基等活性氧物質(zhì)進(jìn)而通過氧化作用殺傷微生物,而不傷害周圍組織和細(xì)胞的一項(xiàng)新技術(shù)[6]?？股厥悄壳耙种苹驓绮≡⑸锏闹饕侄?但近年來隨著抗生素濫用導(dǎo)致了諸如“超級(jí)細(xì)菌”爆發(fā)等事件的不斷出現(xiàn),使人們開始尋找抗生素之外有效且安全的抑菌或殺菌方法[7]。APDT已被證實(shí)具有顯著的殺傷耐藥菌的作用[8],本課題組前期研究已證實(shí)其對(duì)曲霉孢子[9]、金黃色葡萄球菌[10]、蠟樣芽胞桿菌和大腸桿菌[11]具有很好的光動(dòng)力滅活作用。

單核細(xì)胞增多性李斯特菌 (L isterisa m onocytogenes),簡稱單增李斯特菌,是近年來受到特別關(guān)注的一種食源性致病菌。在加拿大、美國和歐洲,肉類食品單增李斯特菌食物中毒案例時(shí)有報(bào)道,感染后發(fā)病致死率高達(dá) 25%以上[12]。隨著我國肉類消費(fèi)大幅增加,尤其是對(duì)冷鮮肉食品的消費(fèi),呈迅速上升趨勢,肉類食品單增李斯特菌污染導(dǎo)致的潛在食物中毒將更加受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)選用單增李斯特菌為實(shí)驗(yàn)菌株,研究血啉甲醚 (hematoporyrin monomethyl ether,HMME)作為光敏劑對(duì)單增李斯特菌的 APDT滅活效果,并利用聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)分析 HMME對(duì)單增李斯特菌菌體蛋白和基因組 DNA的光動(dòng)力影響,探討光動(dòng)力滅菌技術(shù)的作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

單增李斯特菌,廣州市疾病預(yù)防控制中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptone soy broth,TSB),青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

血啉甲醚 (10 mg/mL,批號(hào) 980225),上海第二軍醫(yī)大學(xué)五二三藥物研究室;U21901雙光束紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;75 W溴鎢燈 (光源光功密度為 200 mW/cm2),北京卓立漢光儀器有限公司;TaqMix和細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒,廣州東盛生物科技有限公司。

1.3 引物合成

依據(jù)文獻(xiàn)[13]針對(duì)單增李斯特菌hlyA全基因序列,利用 primer 5.0設(shè)計(jì)引物,委托上海捷瑞生物工程有限公司合成,其序列如下:上游引物 5’-TGC AAG TCC TAA GAC GCC A-3′下游引物 5’-CAC TGC ATC TCC GTG GTA TAC TAA-3′

1.4 單增李斯特菌的光動(dòng)力滅活試驗(yàn)

1.4.1 菌株培養(yǎng)及前處理

將活化的單增李斯特菌接種于 TSB培養(yǎng)液中,37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,離心收集菌體 (4 000 r/min,10 min),棄上清液,重新懸浮菌體于 0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液 (PBS)中,使其OD600=0.05(相當(dāng)于 107CFU/mL左右)。

1.4.2 HMME濃度試驗(yàn)

在 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中 (任取 1孔)加入已處理好的 200μL菌懸液,并加入不同濃度 HMME,使其終濃度分別為 1,5,10,25和 50μg/mL,37℃避光孵育 30 min,放在距離溴鎢燈光源 20 cm處照射 30 min后進(jìn)行平板計(jì)數(shù) (L+S+)。同時(shí)設(shè)置不光照和 或不加 HMME組作為對(duì)照 (L-S-;L+S-;L-S+)。

1.4.3 光照時(shí)間試驗(yàn)

按照 1.4.1方法處理單增李斯特菌后,在 96孔板中 (任取 1孔)各加入 200μL菌懸液并加入HMME,使其終濃度為 25μg/mL,37℃避光孵育 30 min后放在距離溴鎢燈光源 20 cm處照射 5,10,20和 30 min后進(jìn)行平板計(jì)數(shù) (L+S+)。同時(shí)設(shè)置不光照和 或不加 HMME組作為對(duì)照 (L-S-;L+S-;L-S+)。

1.4.4 細(xì)菌菌落平板計(jì)數(shù)

1.4.2 和 1.4.3中不同處理方式所得的菌懸液均以 1∶10梯度稀釋后涂板于細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基平皿中,于 37℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng),24 h后取出進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次,取平均值。

1.5 單增李斯特菌菌體蛋白降解和基因組 DNA損傷試驗(yàn)

1.5.1 菌株培養(yǎng)及前處理

按 1.4.1的方法培養(yǎng)單增李斯特菌,離心收集菌體 (4 000 r/min,10 min),棄上清液,重新懸浮菌體于PBS,使其OD600=0.05,在 96孔板中 (任取 4孔 ),每孔加入 200μL菌懸液并加入 HMME,使其終濃度為25μg/mL,37℃避光孵育 30 min后,放在距離溴鎢燈光源 20 cm處照射 30 min(L+S+)。同時(shí)設(shè)置不光照和 或不加 HMME組作為對(duì)照 (L-S-;L+S-;L-S+)。

1.5.2 SDS-PAGE分析菌體蛋白降解試驗(yàn)

1.5.1 中 4組實(shí)驗(yàn)所得的各 800μL菌懸液置于EP管中,離心棄上清液后 (10 000 r/min,2 min)。加入 20μL無菌去離子水重懸菌體,5μL 4×SDSPAGE上樣緩沖液,95℃加熱 5 min后進(jìn)行 SDSPAGE電泳。

1.5.3 PCR分析基因組DNA斷裂試驗(yàn)

1.5.3.1 單增李斯特菌基因組 DNA的提取

將 1.5.1實(shí)驗(yàn)所得的 4個(gè)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行基因組DNA的提取,單增李斯特菌基因組 DNA抽提按照試劑盒說明書進(jìn)行,抽提所得基因組 DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并作為 PCR檢測 hlyA基因的模板。

1.5.3.2 單增李斯特菌 hlyA基因片段 PCR擴(kuò)增

使用hlyA基因的上下游引物檢測上述 4組單增李斯特菌基因組 DNA的斷裂情況,PCR反應(yīng)體系如下:

單增李斯特菌基因組 DNA模板 1μL;2×PCRMix 10μL;

上游引物 1μL;下游引物 1μL;ddH2O 7μL;PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 5 min;95℃變性 30 s,56℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,30個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸 5 min,反應(yīng)結(jié)束,PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用 GraphPad Prism 5所帶的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。差異顯著性采用t檢驗(yàn),P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 HMM E濃度對(duì)單增李斯特菌光動(dòng)力滅活作用的影響

HMME在 0～50μg/mL內(nèi)對(duì)單增李斯特菌的光動(dòng)力滅活作用見圖1和圖2。從圖1、圖2中可以看出,隨著光敏劑 HMME濃度的增加,對(duì)單增李斯特菌的光動(dòng)力滅活作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng) HMME濃度低至 1 μg/mL的情況下,光照 30 min即可使約 90%的單增李斯特菌滅活。當(dāng) HMME濃度達(dá)到 50μg/mL時(shí),幾乎可完全使單增李斯特菌滅活。而光照對(duì)照組及光敏劑對(duì)照組,均未顯示出明顯的殺傷作用。[0]表明一定濃度的 HMME在光照情況下對(duì)單增李斯特菌有較好的殺傷作用。

圖1 不同濃度 HMME對(duì)單增李斯特菌菌落數(shù) (CFU)的影響

圖2 不同濃度 HMME對(duì)單增李斯特菌失活率的影響

2.2 光照時(shí)間對(duì)單增李斯特菌光動(dòng)力滅活作用的影響

圖3 和圖4顯示了 HMME濃度在 25μg/mL時(shí),光照時(shí)間對(duì)單增李斯特菌的光動(dòng)力滅活作用的影響。光照 10 min以上,均能使菌落總數(shù)降低 2個(gè)數(shù)量級(jí)以上,即 99%以上的單增李斯特菌被滅活;當(dāng)光照時(shí)間達(dá)到 30 min時(shí),幾乎可以完全殺傷單增李斯特菌,滅活率達(dá)到 99.999 9%。表明 HMME在一定濃度下,光動(dòng)力殺菌技術(shù)對(duì)單增李斯特菌的光動(dòng)力殺傷作用隨著光照時(shí)間的延長而加強(qiáng)。

圖3 不同光照時(shí)間的 HMME對(duì)單增李斯特菌菌落數(shù)的影響

2.3 HMM E-APDT對(duì)單增李斯特菌細(xì)菌全蛋白降解效果的影響

圖4 不同光照時(shí)間的 HMME對(duì)單增李斯特菌失活率的關(guān)系

HMME-APDT對(duì)單增李斯特菌細(xì)菌全蛋白的降解作用見圖5,其中條帶M是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) (6.5～175 ku),條帶 1是光敏劑進(jìn)行光照的不帶菌空白條帶,條帶 2是不加光敏劑直接進(jìn)行光照的光照對(duì)照組,條帶 3是不加光敏劑并且不光照的完全對(duì)照組,條帶 4是加光敏劑并且進(jìn)行光照的實(shí)驗(yàn)組,條帶 5則是加光敏劑不光照的光敏劑對(duì)照組。從圖中可以明顯看出,單增李斯特菌在光敏劑 HMME(25μg/mL),光照 30 min的情況下,其菌體大部分蛋白被降解,只在 20 ku處有一降解不完全的條帶。而光照對(duì)照組及光敏劑對(duì)照組與完全對(duì)照組相比較,蛋白條帶無明顯變化。

圖5 HMME-APDT處理后細(xì)菌全蛋白 SDS-PSGE圖譜

2.4 HMM E-APDT對(duì)單增李斯特菌 DNA全基因組損傷效果影響

HMME-APDT對(duì)單增李斯特菌基因組 DNA的影響見圖6,其中條帶 1是不加光敏劑直接進(jìn)行光照的光照對(duì)照組,條帶 2是不加光敏劑并且不光照的完全對(duì)照組,條帶 3是加光敏劑并且進(jìn)行光照的實(shí)驗(yàn)組,條帶 4則是加光敏劑不光照的光敏劑對(duì)照組。與完全對(duì)照組 (L-S-)、光照對(duì)照組 (L+S-)和光敏劑對(duì)照組 (L-S+)相對(duì)比,經(jīng)過 25μg/mL的光敏劑HMME和 30 min的光照處理的實(shí)驗(yàn)組單增李斯特菌基因組DNA斷裂非常明顯,幾乎看不到 DNA片段。為了更準(zhǔn)確比較實(shí)驗(yàn)組與試驗(yàn)對(duì)照組的基因組DNA的斷裂程度,同時(shí)進(jìn)行更為靈敏的 PCR鑒定。

以單增李斯特菌的特異性基因hlyA基因設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行 PCR,結(jié)果見圖7,其中條帶 M是 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) (DL 5000),條帶 1是不加光敏劑直接進(jìn)行光照的光照對(duì)照組,條帶 2是不加光敏劑并且不光照的完全對(duì)照組,條帶 3是加光敏劑并且進(jìn)行光照的實(shí)驗(yàn)組,條帶 4則是加光敏劑不光照的光敏劑對(duì)照組。通過光敏劑 HMME(25μg/mL)和 30 min光照處理的實(shí)驗(yàn)組僅有微弱的 PCR產(chǎn)物生成,而其余各試驗(yàn)對(duì)照組均獲得一明亮的特異性 PCR產(chǎn)物條帶,且條帶大小與所設(shè)計(jì)的hlyA基因片段 112 bp大小吻合。表明單增李斯特菌在一定濃度光敏劑HMME光照30 min的情況下確實(shí)能夠引起基因組 DNA斷裂,且損傷程度較大。

圖6 瓊脂糖凝膠電泳分析 HMME對(duì)單增細(xì)胞李斯特菌光動(dòng)力處理的全基因組圖譜

本研究發(fā)現(xiàn)光功密度 200 mW/cm2的溴鎢燈光照 30 min下,濃度為 25μg/mL的 HMME能殺滅99.999%的單增李斯特菌,光照對(duì)照組或光敏劑對(duì)照組則未觀察到類似殺滅作用。

SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),HMME-APDT對(duì)于活體單增李斯特菌能夠有效降解其絕大部分蛋白質(zhì),這與前人的研究結(jié)果基本一致。Bliss[14]研究報(bào)道,光敏劑對(duì)細(xì)胞的光動(dòng)力失活效應(yīng)中主要涉及脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)變性失活。Tubby[15]等人通過細(xì)菌體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)光敏劑能夠在光照情況下誘發(fā)蛋白質(zhì)降解。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明,光動(dòng)力技術(shù)的滅菌效果,可能是通過氧化降解等途徑[16]引起細(xì)菌內(nèi)蛋白降解,從而導(dǎo)致單增李斯特菌失活。

圖7 單增李斯特菌 hlyA基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果

Menezes[17]在研究光動(dòng)力滅活大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),APDT能夠造成其基因組 DNA損傷。本研究中,HMME-APDT被發(fā)現(xiàn)同樣能夠有效降解單增李斯特菌的基因組 DNA。結(jié)果表明,HMME-APDT的滅菌作用不僅來自于對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)的變性,還來自于細(xì)菌基因組DNA斷裂破壞作用。

HMME作為一種新型光敏劑,屬于天然產(chǎn)物,因來源廣泛,安全性較高,可以作為一種很有前景的滅菌技術(shù)應(yīng)用于肉類食品工業(yè)。

3 結(jié)論

濃度為 25μg/mL的 HMME在光功密度為 200 mW/cm2的可見光光照 30 min下,對(duì)單增李斯特菌的光動(dòng)力滅活效果高達(dá) 99.999 9%,并能導(dǎo)致其蛋白質(zhì)和基因組降解,表明光動(dòng)力技術(shù)對(duì)單增李斯特菌具有極強(qiáng)的滅活作用,蛋白質(zhì)降解和基因組 DNA受損可能是 HMME-APDT有效滅活單增李斯特菌的作用機(jī)理。

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