分子排阻色譜法測(cè)定云芝糖肽的分子量分布

高 平

（江蘇江山制藥有限公司，江蘇靖江 214500）

分子排阻色譜法測(cè)定云芝糖肽的分子量分布

高 平

（江蘇江山制藥有限公司，江蘇靖江 214500）

目的建立分子排阻色譜法測(cè)定云芝糖肽的分子量分布的方法。方法用分子排阻色譜法，色譜柱：TS Kgel G4000S W（7.5mm×300mm）柱，流動(dòng)相：0.02mol/L醋酸鈉溶液，柱溫：30℃,已知分子量右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)品作校正標(biāo)準(zhǔn)，示差折光檢測(cè)器。流速：0.50mL/min；進(jìn)樣量：10μL。結(jié)果根據(jù)建立的方法測(cè)定，分析了3批樣品，得到云芝糖肽的排阻色譜圖并計(jì)算出重均分子量大于40000的相對(duì)百分比為59.7%，63.6%，66.6%。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、快速，可用云芝糖肽的質(zhì)量控制。

云芝糖肽；分子排阻色譜法；分子量分布；測(cè)定

云芝糖肽（Posaverptidum,簡(jiǎn)稱PSP）系從多孔菌科植物云芝（Coriolusversicolor L．ex．Fr．）Quel．（菌株Cov-1）的菌絲體中提取的高分子糖肽聚合物，主要活性成分是結(jié)合蛋白多糖（Proteoglycan），作為一種有效的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，應(yīng)用于腫瘤的治療，增強(qiáng)人體免疫功能的作用[1]。云芝糖肽的免疫激活活性與其分子量分布密切相關(guān)，分子量小于4000時(shí)幾乎沒(méi)有活性，該品重均分子量大于4萬(wàn)的不少于50%。應(yīng)用高效分子排阻色譜法[2-3]測(cè)定了云芝糖肽的分子量分布，為考察工藝的穩(wěn)定性及快速控制產(chǎn)品質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司1100型）；示差折光檢測(cè)器，（Agilentchemstation，Rev.A10.02,GPC Dateanalysiss of tware，Rev.A 02.02）；電子分析天平（賽多利斯BP211D）；LD4-2A離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；Anke TGL-16c高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；十種右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：140637-2000-01）；醋酸鈉為色譜純（美國(guó)dionex公司）；葡萄糖和乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純；藍(lán)色葡聚糖為S I G M A公司試劑；實(shí)驗(yàn)用水為二次重蒸水；云芝糖肽樣品3批（江蘇華信制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為100701，100702，100703）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：TS KgelG4000S W（7.5mm×300mm）柱；流動(dòng)相：0.02m o l/L醋酸鈉溶液；柱溫：30℃；流速：0.50mL/min；進(jìn)樣量：10μL；數(shù)據(jù)采集時(shí)間：60min。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

理論板數(shù)：精密稱取葡萄糖10mg，至10mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解，并定容至刻度，得1mg/mL的溶液，按“2.1色譜條件”進(jìn)樣，記錄色譜圖。凝膠色譜柱按葡萄糖峰計(jì)理論板數(shù)由色譜工作站直接讀出Plates=14635。分配系數(shù)（K d） 計(jì)算：取葡萄糖、藍(lán)色葡聚糖、供試品適量，分別加流動(dòng)相制成每1mL約含10mg的溶液，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，按“2.1色譜條件”進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果樣品主峰K D＝（tR-t 0）/（tT-t0）=0.63，KD在0～1之間，符合分子量測(cè)定要求。式中tR為供試品主峰保留時(shí)間，t0為藍(lán)色葡聚糖峰保留時(shí)間，tT為葡萄糖峰保留時(shí)間。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用已知分子量的右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)樣品分子量的大小，選用重均分子量（MW）為10000，21400，41100，84400，133800的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取標(biāo)準(zhǔn)品適量，加流動(dòng)相制成10mg/mL的溶液。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣10μl，記錄色譜圖，用G P C軟件以右旋糖酐對(duì)照品重均分子量對(duì)數(shù)值lg MW對(duì)保留時(shí)間t R進(jìn)行回歸處理，標(biāo)準(zhǔn)曲線 （見圖 1），回歸方程：Lg Mw＝7.5161-0.16129tR，相關(guān)系數(shù)為r=-0.99675，具有良好的線性關(guān)系。

圖1 GPC校正曲線

2.4 樣品處理

取樣品2.0g，加水50mL充分溶解，以3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液40mL，分三次加入乙醇60mL，搖勻，在4℃放置1小時(shí)，以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取出沉淀物在80℃干燥4小時(shí)。干燥沉淀物用瑪瑙研缽研細(xì)，取適量，精密稱定，用流動(dòng)相溶解并制成每1mL中約含10mg的溶液，以10000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心10分鐘，用5mL注射器吸取上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后待進(jìn)樣。

2.5 精密度考察

取批號(hào)為100701供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)測(cè)定6次，根據(jù)G P C曲線計(jì)算重均分子量（M W） 大于40000的百分比為59.7%、60.0%、59.8%、59.2%、60.2%、60.3%，R S D為0.60%，表明該系統(tǒng)精密度良好，儀器連續(xù)進(jìn)校誤差較小，符合《中國(guó)藥典》的要求。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為100701的樣品，按“2.2”項(xiàng)下分別制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定分子量分布，根據(jù)G P C曲線計(jì)算重均分子量 （M W） 大于40000的百分比為59.7%、60.6%、59.6%、60.6%、60.2%、59.6%，R S D為0.67%，表明該分析方法測(cè)定樣品分子量的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察

取批號(hào)為100701供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件在0、4、8、12、16、20、24小時(shí)分別測(cè)定分子量分布，根據(jù)G P C曲線計(jì)算重均分子量 （M W） 大于40000的百分比為59.7%、60.0%、60.4%、60.1%、60.6%、59.2%、59.4%，R S D為0.85%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，儀器的穩(wěn)定性良好。

2.8 樣品測(cè)定

取3批云芝糖肽，按“2.4”項(xiàng)下制備供試品溶液3份，然后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，樣品分離色譜圖見圖2、分子量分布圖見圖3、根據(jù)G P C曲線計(jì)算分子量大于40000百分含量見表1。

圖2 樣品分離色譜圖

圖3 分子量分布圖

表1 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

（1）本文采用凝膠色譜法測(cè)定云芝糖肽分子量分布，并對(duì)此方法進(jìn)行了系統(tǒng)適應(yīng)性、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察，證明該法具有操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，可用于生產(chǎn)質(zhì)量控制。

（2）本實(shí)驗(yàn)曾對(duì)中TSK-GELG 4000P W和G 5000P W兩柱串聯(lián)使用[2]進(jìn)行了比較，結(jié)果表明：串聯(lián)使用雖然增大了分子排阻范圍，但分辨率并不高。TSK-GELG 4000S W色譜柱更適合分離這種含有結(jié)合蛋白的多糖大分子。

（3）由于流動(dòng)相鹽濃度相對(duì)較低，易生長(zhǎng)細(xì)菌，故建議色譜柱及時(shí)清洗并在適當(dāng)條件下保存以延長(zhǎng)色譜柱使用壽命。

1]N gT B．A review ofresearch on theprotein-bound polysaccharide （polysaccharopeptide,PSP）from the mushroom Coriolus versicolor（basidiom ycetes:Polyporaceae）[J].G eneral Pharm acology ,1998,30（1）,l-4．

[2]張志花,楊曉彤,方積年.云芝糖肽在高效液相凝膠柱上色譜行為的研究[J].色譜,1997,15（02）:150-151.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

Determination of the Molecular Weight Distribution of Posaverptidum（PSP）by GPC

GAO Ping
（Aland（Jiangsu）Nutraceutical Co.,Ltd.,Jingjiang Jiangsu 214500,China）

Objective To establish GPC method of analysis the molecular weight and molecular weight distribution of Posaverptidum.Methods Using HPSEC method,the TSK G4000SW column was useDAt 30℃,with 0.02mol/L sodium acetate solution were useDAs mobile phase,and with a flow rate of 0.50ml/min anDAn injection volume of 10μ L,using dextrans with known molecular weights as calibration standards，and RI detector was used.Results A method was establisheDAnd three samples were analyzed by the method.The chromatograms and Weight-average molecular weights and Relative content of weight-average molecular weight more than 40,000of polysaccharide in the samples were obtained 59.7%，63.6%，66.6%.Conclusion The method is simple，rapiDAnd convenient．It can be used in the quality control of Posaverptidum.

posaverptidum;GPC;molecular weight distribution;determination

O63文獻(xiàn)標(biāo)設(shè)碼：A

1671-0142（2011）02-0061-02

高平（1976-），男，江蘇靖江人，工程師.

（責(zé)任編輯施 翔）