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    鄰苯三酚紅-銅(Ⅱ)分光光度法測(cè)定牛奶中的蛋白質(zhì)

    2011-01-12 09:14:30馬占玲顧佳麗曾凌
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2011年12期
    關(guān)鍵詞:苯三酚光度法分光

    馬占玲,顧佳麗,曾凌

    (渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院,遼寧錦州,121013)

    目前有不少測(cè)定蛋白質(zhì)的方法,如凱氏定氮法、分光度法[1-6]、熒光法[7]和新發(fā)展起來(lái)的共振瑞利光散射分析法[8-9]等。分光光度法因其簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。其中應(yīng)用最多的是考馬斯亮藍(lán)法。染料結(jié)合法也是一種簡(jiǎn)便而常用的方法,目前文獻(xiàn)報(bào)道的染料有:曙紅[10]、茜素紅、四溴螢光黃二鈉鹽、鈣黃綠素[11]、偶氮胂(Ⅲ)-鑭(Ⅲ)[12]等。但這些方法均存在受雜質(zhì)干擾嚴(yán)重,操作復(fù)雜,不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。本文研究了一種新的測(cè)定牛奶中蛋白質(zhì)的光度分析法——鄰苯三酚紅-銅絡(luò)合物法,采用該方法測(cè)定牛奶中的蛋白質(zhì)含量,獲得較理想的分析結(jié)果。

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    牛血清白蛋白(BSA),上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司;鄰苯三酚紅、CuSO4(均為分析純)。

    1.2 儀器

    756紫外-可見分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    在中性條件下,鄰苯三酚紅與銅絡(luò)合生成紫色絡(luò)合物,加入BSA或牛奶后顏色變深。分別測(cè)定增色前后吸光度值,然后求出吸光度差值ΔA。因?yàn)棣與蛋白質(zhì)的濃度成正比,進(jìn)而求出樣品中蛋白質(zhì)的含量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

    牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液在最佳條件下使鄰苯三酚紅銅的絡(luò)合體系增色,用去離子水做參比,對(duì)增色體系進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,確定最大吸收波長(zhǎng),結(jié)果見圖1。

    圖1 最大吸收波長(zhǎng)掃描圖

    從圖1看出,吸收曲線呈不規(guī)則拋物線形,在200~800 nm有2個(gè)吸收峰。本實(shí)驗(yàn)選擇第2個(gè)吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)517 nm為測(cè)量波長(zhǎng)。

    2.2 最佳實(shí)驗(yàn)條件的確定

    2.2.1 鄰苯三酚紅最佳用量的確定

    在固定其他顯色條件不變的前提下,只改變鄰苯三酚紅溶液的體積V鄰,測(cè)其吸光度。同時(shí)測(cè)定未加牛血清白蛋白工作液體系的吸光度,計(jì)算兩溶液的吸光度之差ΔA,結(jié)果見圖2。

    圖2 鄰苯三酚紅用量對(duì)吸光度差值的影響

    從圖2看出,鄰苯三酚紅的體積在0~2.00 mL,ΔA隨鄰苯三酚紅用量的增加而增大,鄰苯三酚紅溶液的體積在2.00 mL后吸度差值變化不大,因此選擇2.00 mL為鄰苯三酚紅溶液的最佳用量。

    2.2.2 CuSO4溶液的用量

    按實(shí)驗(yàn)步驟操作,只改變CuSO4溶液的用量,考察它對(duì)吸光度之差ΔA的影響。在0.00~0.80 mL,ΔA隨CuSO4溶液體積的增加逐漸增大,在0.80 mL時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)體積大于0.80 mL后,吸光度差值逐漸減小。因此選擇0.80 mL為CuSO4的最佳用量。即鄰苯三酚紅與Cu2+的最佳摩爾比是5∶2。

    2.2.3 加熱溫度的確定

    取2個(gè)50 mL容量瓶,加入14.00 mL鄰苯三酚紅-Cu2+混合溶液,一只容量瓶中加入5.00 mL牛血清白蛋白工作液,另一只容量瓶不加。在不同溫度下放置10 min,然后在517 nm處測(cè)量其吸光度之差ΔA。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ΔA在10~30℃變化較小,30℃以后逐漸減小,因此選擇20℃為測(cè)量溫度。

    2.2.4 反應(yīng)時(shí)間的確定

    按實(shí)驗(yàn)操作步驟,顯色體系在室溫下靜置不同時(shí)間后立刻用紫外可見分光光度計(jì)在517 nm處測(cè)量其吸光度之差ΔA,考察時(shí)間對(duì)吸光度差值的影響,結(jié)果見圖3。

    圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)△A的影響

    由圖3可見,反應(yīng)在5~50 min,ΔA隨時(shí)間的延長(zhǎng)而變化不大,可見反應(yīng)體系比較穩(wěn)定。綜合考慮,選擇反應(yīng)時(shí)間為10 min。

    2.3.5 工作曲線的繪制

    取6個(gè) 10 mL比色管,分別加入 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液和2.80 mL鄰苯三酚紅與CuSO4的混合溶液;在最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行顯色,測(cè)量。以牛血清白蛋白的濃度為橫坐標(biāo),ΔA為縱坐標(biāo),繪制工作曲線。得到工作曲線方程為 ΔA=0.01c-0.025 5,相關(guān)系數(shù)為0.990 3。

    2.3.6 樣品測(cè)定

    采用本方法對(duì)市售牛奶進(jìn)行測(cè)量,同時(shí)采用國(guó)標(biāo)法——乙酰丙酮,甲醛法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn),結(jié)果見表1。

    表1 樣品測(cè)定結(jié)果

    由表1可見,采用鄰苯三酚紅-銅(Ⅱ)法測(cè)定牛奶中蛋白質(zhì)的含量與國(guó)標(biāo)法相比,誤差在1.8% ~2.8%,準(zhǔn)確度較高,而且精密度較好,相對(duì)平均偏差在1.61%~2.58%。

    2.3.7 回收率的測(cè)定

    4個(gè)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)測(cè)得結(jié)果見表2。回收率在93.1% ~108.5%,在光度允許誤差范圍之內(nèi)。

    表2 回收率的測(cè)定

    3 結(jié)論

    采用中性鄰苯三酚紅-銅(Ⅱ)絡(luò)合體系測(cè)定牛奶中蛋白質(zhì)含量,方法準(zhǔn)確度較高,精密度也較好,而且顯色體系比較穩(wěn)定。采用該方法測(cè)定多種牛奶樣品中的蛋白質(zhì)含量,與國(guó)標(biāo)法比較,結(jié)果令人滿意。

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