對鎘高抗性及吸附性的魯氏酵母突變株的選育*

李春生，徐瑩，姜維，劉文磊，汪東風

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島，266003)

水體中的重金屬污染主要源于采礦、冶煉、電鍍、印染等行業(yè)的工業(yè)廢水及生化污水的隨意排放［1－2］。這些重金屬污染物可以通過食物鏈富集并傳遞，從而對人類飲食安全和身體健康構(gòu)成了嚴重威脅。目前，常用的水體重金屬污染物處理方法主要有絮凝沉淀法、吸附法、離子交換法及生物法等。其中，微生物吸附法因具有細胞生長繁殖快、吸附能力強且比表面積大等特點，已成為當前一個重要的研究方向［3－4］。微生物吸附主要是通過選擇優(yōu)良的微生物作為吸附劑，直接或與固定化等其他技術(shù)結(jié)合脫除重金屬。目前，國內(nèi)外學(xué)者在這方面已做了大量工作，如通過篩選或構(gòu)建吸附能力強的微生物菌種，改善培養(yǎng)基組成，以及細胞經(jīng)酸、堿、有機溶劑處理或化學(xué)修飾、通過基因工程改造菌株等手段來提高微生物吸附能力［5－8］。但篩選出在污染環(huán)境中既能大量生長又有較高重金屬吸附能力的微生物是相當艱難的工作。通過誘導(dǎo)育種構(gòu)建在逆境中既能良好地生長又能具備重金屬處理性能，并對環(huán)境無害的工程菌是實現(xiàn)該工藝實際應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一［9］。

酵母菌用于處理水體重金屬污染的研究工作較多，但多數(shù)都集中在采用釀酒酵母這種模式菌來進行的。魯氏酵母是醬油等釀造生產(chǎn)過程中的常用菌株，其耐鹽性比釀酒酵母的更強。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，耐鹽魯氏酵母對 Cd2+有一定的吸附能力［10－11］。但是，為了提高其吸附效率和實際應(yīng)用，其重金屬鎘脫除能力還需進一步提高。本研究旨在以工業(yè)用魯氏酵母為出發(fā)菌株，通過紫外誘變，選育出對Cd2+具有更高抗性的菌株;同時對所得菌株進行鎘生物吸附能力分析，以期選育出對Cd2+具有更高吸附能力的菌株，為采用微生物法脫除食品及水環(huán)境的重金屬鎘的研究提供有用菌株。

1 材料與方法

1.1 出發(fā)菌株

親株采用魯氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)CICC1379，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基與Cd2+溶液

麥芽汁固體斜面培養(yǎng)基:6～7°Bé的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。

YEPD固體平板培養(yǎng)基:蛋白胨20 g，酵母膏10 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，自來水 1 000 mL，pH 6.0。不加入瓊脂時即為YEPD液體培養(yǎng)基。

Cd2+溶液:稱取適量的CdCl2·2.5H2O(AR，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司)，用超純水溶解，配成Cd2+含量為1 000 mg/L的溶液，使用時用超純水稀釋到所需濃度。

1.3 Z．rouxii CICC1379鎘抗性水平檢測

采用最低抑菌濃度(MIC)法，參照文獻［12］。

1.4 紫外線誘變

1.4.1 誘變致死曲線的繪制

參照文獻［13］。

1.4.2 紫外線誘變及篩選

（5）缸筒表面外觀質(zhì)量 激光淬火后，缸筒淬火區(qū)無明顯的氧化脫碳現(xiàn)象，表面粗糙度值較低，經(jīng)磁粉無損檢測后表面無微小裂紋現(xiàn)象。并經(jīng)專業(yè)的檢測手段檢測缸筒淬火區(qū)沒有變形缺陷產(chǎn)生。

取對數(shù)期Z．rouxiiCICC1379酵母菌懸液移入帶有磁力攪拌棒的無菌平板中，選擇合適的紫外線(15 W)照射時間(致死率為70% ～80%)進行紫外誘變。將所得的菌懸液加入到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基，28℃、180 r/min，培養(yǎng)24h。所得的菌體離心(4 000 r/min，10 min)用0.85%無菌生理鹽水洗滌2次并收集菌體，再將所得菌體用0.85%無菌生理鹽水梯度稀釋至濃度約為103個/mL后涂布到含Cd2+的YEPD固體平板培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)，挑出優(yōu)勢菌落。將初篩選出的菌株分別進行鎘抗性水平檢測和生物量的測定，并與親株進行比較。根據(jù)以上2個指標篩選出比較理想的菌株。

1.4.3 遺傳穩(wěn)定性檢測

測定復(fù)篩選出的菌株的MIC，與培養(yǎng)前菌株的MIC比較后即得到10個世代的穩(wěn)定性。20世代的穩(wěn)定性測定，則以24h的培養(yǎng)液作為種子液，以此類推，直至50個世代。

1.5 酵母凍干粉吸附實驗

1.5.1 酵母凍干粉吸附實驗

分別稱取0.1 gZ．rouxiiCICC1379和突變株的凍干粉(制備方法參見文獻［10］)，投到裝有20 mL不同鎘濃度梯度的三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為100 r/min的搖床中振蕩吸附30 min。迅速取出并經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取上清液，適當稀釋后測定Cd2+濃度。以上清液中Cd2+濃度降低的百分比為Cd2+脫除率(Q)，即:

式中:c0，吸附前溶液中Cd2+濃度，mg/L;ce，吸附后溶液中Cd2+濃度，mg/L。

1.5.2 Cd2+測定方法

1.6 統(tǒng)計分析

每個實驗處理重復(fù)3次，實驗所獲得的值用平均值±標準偏差(M±SD)的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 最低抑菌濃度(MIC)的確定及 Z．rouxii CICC1379鎘抗性水平分析

培養(yǎng)時間與Z．rouxiiCICC1379的MIC之間的關(guān)系如圖1所示。結(jié)果表明，同樣的處理但是經(jīng)過不同的培養(yǎng)時間，MIC值明顯地不同。這是因為在低Cd2+濃度條件下，Cd2+只有明顯的抑菌作用，而無明顯的致死作用，經(jīng)過適應(yīng)性調(diào)整后仍能夠生長。

圖1 培養(yǎng)時間對Z．rouxii CICC1379 MIC的影響

培養(yǎng)時間為24h時，對Z．rouxiiCICC1379的MIC進行測試，結(jié)果如表1所示，Z.rouxiiCICC1379的MIC約為6 mg/L，即Z.rouxiiCICC1379的鎘抗性約為6 mg/L。

表1 Z．rouxii CICC1379在含鎘YEPD固體平板培養(yǎng)基培養(yǎng)24h的菌落數(shù)

2.2 Z．rouxii CICC1379的生長曲線

供誘變處理的酵母菌一般要求處于對數(shù)生長期，此時群體生長狀況比較同步，易變異，重復(fù)性較好，故選用對數(shù)期的細胞進行處理。以培養(yǎng)時間(t)為橫坐標，以每毫升酵母菌個數(shù)(N)為縱坐標，繪制出Z.rouxiiCICC1379的生長曲線如圖2所示。由圖2可知，對數(shù)生長時期為4～12 h，為了保證處理時具有一定的細胞濃度，以增加可變異的細胞總數(shù)，故選擇已培養(yǎng)了10 h的菌液進行誘變處理。

2.3 紫外線誘變及鎘抗性菌株的篩選

圖2 Z．rouxii CICC1379生長曲線

2.3.1 紫外誘變致死時間的確定

紫外誘變處理劑量的選擇是一個比較復(fù)雜的問題，一般正突變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負突變則較多出現(xiàn)于偏高劑量中。因此，目前已傾向于低劑量處理細胞，致死率一般控制在70% ～80%。Z.rouxiiCICC1379紫外誘變致死曲線如圖3所示，紫外線處理時間為30s時，致死率為78.85%，故選用紫外線處理時間30s來進行誘變處理。

圖3 紫外誘變致死曲線

2.3.2 抗性突變株的篩選

為了從紫外誘變所得的菌懸液篩選出較理想的菌株，經(jīng)過初篩后，挑選出 3株較優(yōu)突變體，即Cd102，Cd103，Cd104，再分別以突變株的生物量及鎘抗性兩個指標進行復(fù)篩。初篩獲得的各突變株與Z.rouxii CICC1379的生物量如表2所示。從表2可以看出各突變株的生物量與親株的生物量相比沒有太大的差異，表明突變過程對這些菌株的生長繁殖影響較小，各突變株生長繁殖正常。

表2 Z.rouxii CICC1379和誘變菌株生物量及鎘抗性比較

采用MIC法測定各突變株的鎘抗性水平，由表2可知，突變株Cd102，Cd103，Cd104的鎘抗性較親株分別提高了3.3倍、1.0倍和1.3倍。

由以上兩個指標可以看出，與出發(fā)菌株相比，突變株Cd102鎘抗性提高較明顯，且生長繁殖正常，因此繼續(xù)對此菌進行遺傳穩(wěn)定性檢測及鎘吸附能力研究。

2.3.3 突變株Cd102的遺傳穩(wěn)定性

采用MIC法對Z.rouxiiCICC1379及突變株Cd102進行50世代的遺傳穩(wěn)定性檢測，結(jié)果見圖4。

圖4 Z．rouxii CICC1379及其突變株Cd102的遺傳穩(wěn)定性

突變株Cd102前30代 Cd2+抗性均保持在100%，第40代遺傳穩(wěn)定性開始下降，但下降幅度不大，在第50代其遺傳穩(wěn)定性仍保持在92.3%。由圖4可以看出魯氏酵母突變株Cd102對Cd2+抗性，具有較高的遺傳穩(wěn)定性，在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)50世代，其穩(wěn)定性保持在90%以上。

2.4 突變株的鎘生物吸附能力分析

Z．rouxiiCICC1379與突變株Cd102對不同初始Cd2+濃度溶液的吸附實驗結(jié)果如圖5所示，突變株Cd102的吸附能力明顯地較原始菌株有所提高，即對于該突變株而言，鎘抗性增強其吸附能力也增強。隨著初始Cd2+濃度的增加，Cd2+脫除率呈現(xiàn)下降趨勢。這是因為高初始濃度增加了克服水相與固相之間重金屬傳質(zhì)阻力所需的驅(qū)動力，導(dǎo)致了Cd2+與吸附劑的高碰撞幾率，這大大增加了溶液中單位生物量的重金屬吸附數(shù)量，直至達到飽和，但是由于Cd2+的初始濃度過高，鎘脫除率卻下降［14］。

圖5 Z.rouxii CICC1379與突變株Cd102凍干粉的Cd2+吸附性能比較

微生物突變體的重金屬抗性與吸附性存在兩種關(guān)系:一種為重金屬的抗性增加但其吸附能力下降，這主要是由于排斥機制導(dǎo)致其抗性增加［14－15］。另一種為重金屬的抗性與吸附性同時增加，其機理主要有兩方面:一方面是由于微生物的表面吸附作用，經(jīng)過誘導(dǎo)后，微生物的細胞壁、細胞膜成分改變，在細胞表面產(chǎn)生能與重金屬形成晶體的大分子物質(zhì)，吸附重金屬時，這些大分子物質(zhì)與其螯合，從而增加其吸附能力;另一方面主要是指能進行新陳代謝的活細胞而言，由于微生物細胞內(nèi)的累積作用，誘變調(diào)動了微生物體內(nèi)的抗性基因，在細胞內(nèi)形成能大量容納重金屬離子的生物大分子，如金屬硫蛋白、操縱子、金屬運輸酶和透性酶等，這些物質(zhì)與重金屬離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的重金屬離子－生物大分子的結(jié)合態(tài)，從而降低了重金屬對菌體內(nèi)其他生物物質(zhì)的破壞，增強了突變株對鎘的抗性和吸附能力［9］。本研究獲得的突變株Cd102的重金屬的抗性與吸附性同時增加。MIC法測定其Cd2+抗性為26 mg/L，明顯高于親株(6 mg/L)，相應(yīng)的其Cd2+吸附性能提高較為明顯。初始Cd2+濃 度 分 別 為 0.775、3.205、6.843、36.335、67.075 mg/L時，突變株Cd102的Cd2+脫除率分別較親株提高了 7.01%、12.85%、15.3%、8.65%、1.07%?？梢?，突變株Cd102在中低濃度Cd2+脫除方面較親株表現(xiàn)了更強的吸附能力，而在初始Cd2+濃度為67.075 mg/L時，突變株Cd102的Cd2+脫除率與親株相近，表明Cd102在脫除高濃度Cd2+方面，其吸附能力并沒有太大提高。由于本研究采用的是酵母凍干粉吸附實驗，酵母菌處于休眠體狀態(tài)，其吸附機制主要是由于細胞的表面吸附作用，由此可以推測，紫外誘變更多的是導(dǎo)致Cd102細胞表面結(jié)構(gòu)上的變化，使其對Cd2+的選擇性吸附能力增強，而總的吸附位點并沒有太多增加，表現(xiàn)為其對高Cd2+下脫除率沒有太大的變化，其機理有待進一步研究。

3 結(jié)論

篩選出遺傳穩(wěn)定的突變株Cd102，其鎘抗性為26 mg/L，較Z.rouxiiCICC1379提高了3.3倍。突變株Cd102的Cd2+吸附性也相應(yīng)的提高，突變株Cd102在中低濃度Cd2+脫除方面較Z.rouxiiCICC1379表現(xiàn)了更強的吸附能力。

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