黃傘子實(shí)體多糖PAP2的分離純化及其結(jié)構(gòu)初步鑒定

聶永心，姜紅霞，蘇延友，朱常香，溫孚江

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安，271018)2(泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安，271016)

真菌多糖是自然界中存在種類較多、生物活性較高的一類活性多糖，近年來研究發(fā)現(xiàn)，真菌多糖具有免疫增強(qiáng)與調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等廣泛的生物活性［1－2］，是公認(rèn)的安全低毒活性物質(zhì)，成為國內(nèi)外專家學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。數(shù)據(jù)顯示，黃傘多糖具有抑菌［3］、抗氧化［4］、抗腫瘤［5－6］等廣泛的生物活性。目前有關(guān)黃傘子實(shí)體多糖的研究很少，對(duì)其多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)分析方面還未見有報(bào)道。本研究主要對(duì)黃傘子實(shí)體多糖進(jìn)行提取與純化，通過高效液相色譜(HPLC)、高效凝膠滲透色譜(HPGPC)、紅外光譜(IR)、核磁共振(NMR)等方法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定，以期為進(jìn)一步研究黃傘子實(shí)體多糖的藥理作用及構(gòu)效關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃傘子實(shí)體，由泰山醫(yī)學(xué)院蘇延友教授培育提供;單糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海國藥集團(tuán)，三氟乙酸(TFA)，Sigma公司，Dextran系列標(biāo)準(zhǔn)品，GE公司產(chǎn)品;無水乙醇、甲醇、氯仿、正丁醇等所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

KTA Purifier純化系統(tǒng)，美國GE公司;S-3100紫外分光光度計(jì)，韓國SCINCO公司;Agilent 1200高效液相色譜儀(配備1200 serials蒸發(fā)光散射檢測器)，美國安捷倫公司;Nicolet380傅立葉變換紅外光譜儀，美國熱電集團(tuán);AVANCE 600傅立葉變換核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司

1.3 方法

1.3.1 黃傘子實(shí)體多糖的提取純化

稱取黃傘子實(shí)體100 g，加入1∶1的乙醇-乙醚混合液，于65℃水浴回流脫脂2 h，殘?jiān)屑舆m量水(水料比20∶1)，100℃水浴提取3次，每次4 h，過濾，將濾液合并，濃縮，加入氯仿-正丁醇(4∶1)，充分振蕩30 min，5 000 r/min離心20 min，取上層水相重復(fù)除蛋白質(zhì)8次，水相用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至4.0，加入1%的活性炭，50℃脫色30 min，離心除去活性碳，重復(fù)2次，上清液過濾，加入5倍體積的無水乙醇，4℃靜置過夜，離心，加適量水溶解，真空冷凍干燥得灰白色絮狀黃傘子實(shí)體粗多糖(PAP)。

將PAP過DEAE-Sepharose Fast Flow柱(1.6 cm×10 cm)，先以蒸餾水洗脫，再用0～2 mol/L的NaCl進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液3 mL/管收集，苯酚硫酸法A490檢測，合并相同流分，濃縮，透析，冷凍干燥得PAP1和PAP2兩個(gè)組分，PAP2為主要組分。PAP2再過SuperdexTM200柱(1 cm×30 cm)，蒸餾水洗脫，1 mL/管收集，苯酚硫酸法A490檢測，合并相同流分，濃縮，透析，冷凍干燥，得白色絮狀黃傘子實(shí)體多糖(PAP2)。

1.3.2 黃傘子實(shí)體多糖PAP2的均一性和分子質(zhì)量測定

采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)對(duì)PAP2進(jìn)行均一性及分子質(zhì)量的測定。色譜條件:色譜柱為TSK-G4000PWXL 柱(7.8 mm ×300 mm，10 μm)，流動(dòng)相為雙重純蒸水;流速1 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;柱溫40℃;蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測。

1.3.3 HPLC-ELSD法測定黃傘子實(shí)體多糖PAP2的單糖組成

(1)色譜條件:Prevail Carbohydrate ES柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，柱溫 25℃;流動(dòng)相為乙腈-水(85∶15)，流速0.8 mL/min;ELSD檢測器溫度80℃，輔助氣(N2)壓力3.5 bar，增益(gain)為6。

(2)樣品處理:稱取5 mg黃傘子實(shí)體多糖于安培瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸(TFA)2 mL，110℃封管水解2 h，水解液減壓濃縮至干，再加甲醇3 mL蒸干，重復(fù)3次，以除盡TFA。加少量水溶解，水解產(chǎn)物經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液20 μL用于液相分析，與7種標(biāo)準(zhǔn)單糖對(duì)照品的色譜圖比較確定單糖的種類和比例。

1.3.4 黃傘子實(shí)體多糖PAP2的紅外光譜分析

稱取5 mg黃傘子實(shí)體多糖PAP2與200 mg干燥的KBr粉末在研缽中研磨均勻，壓片，上機(jī)在4000～400 cm－1內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.5 黃傘子實(shí)體多糖PAP2的核磁共振波譜分析

取10 mg多糖PAP2溶于0.5 mL重水中，在核磁共振儀上進(jìn)行1H NMR、13C NMR譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃傘子實(shí)體多糖PAP2的分離純化

黃傘子實(shí)體經(jīng)熱水提取、醇沉、Sevag脫蛋白及活性炭脫色得黃傘子實(shí)體粗多糖(PAP)，PAP經(jīng)DEAESepharose Fast Flow離子交換柱分離得到2個(gè)組分(如圖1A)，其中PAP2為主要組分;PAP2經(jīng)SuperdexTM200凝膠柱進(jìn)一步分離純化得到1個(gè)組分(如圖1B)，將洗脫液濃縮、透析、冷凍干燥得白色絮狀多糖PAP2。

2.2 PAP2的均一性及分子質(zhì)量測定

將系列葡聚糖(Dextran)標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配成質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.2%的溶液，按上述HPGPC色譜條件測定保留時(shí)間，與葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量對(duì)數(shù)作圖得線性回歸方程:lgMw=8.558 4－0.4849tR，r2=0.997。PAP2在HPGPC上得到一個(gè)單一對(duì)稱峰(如圖2所示)，表明其為均一組分。根據(jù)PAP2的保留時(shí)間，由回歸方程計(jì)算得PAP2的平均分子質(zhì)量為2.1 ×106u。

2.3 PAP2的單糖組成分析

黃傘子實(shí)體多糖水解產(chǎn)物的高效液相色譜分析結(jié)果如圖4所示，與混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的高效液相色譜圖(圖3)中各標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)照分析，發(fā)現(xiàn)在黃傘子實(shí)體純化多糖PAP2水解產(chǎn)物中只有葡萄糖，表明其是由葡萄糖組成的均一多糖。本課題組前期研究表明黃傘子實(shí)體多糖(PAP)單糖組成中主要含有葡萄糖外，還含有少量木糖和甘露糖［7］，可能為其他多糖組分含有的單糖或游離的單糖。

圖1 黃傘子實(shí)體多糖(PAP)的DEAE-Sepharose Fast Flow(A)與SuperdexTM 200(B)柱層析圖

圖2 黃傘子實(shí)體多糖純化組分PAP2的HPSEC色譜圖

圖3 7種標(biāo)準(zhǔn)單糖的高效液相色譜圖

圖4 黃傘子實(shí)體多糖PAP2中單糖組分的高效液相色譜圖

2.4 PAP2的紅外光譜分析

PAP2紅外光譜分析結(jié)果如圖5所示，其中3 349.34 cm－1處的強(qiáng)吸收峰是－OH伸縮振動(dòng)引起的吸收;2 921.86 cm－1為飽和C-H伸縮振動(dòng)吸收;在1 641.74 cm－1的 峰 是 多 糖 水 合 振 動(dòng) 吸 收 峰［8］;1 369.07 cm－1出現(xiàn)的峰是由于C－H變角振動(dòng)引起的;1 150.42 cm－1、1 078.99 cm－1、1 022.77 cm－1三個(gè)峰為吡喃糖環(huán)特征吸收峰，是其糖苷鍵C－O－C的非對(duì) 稱振 動(dòng)峰［9］; 紅 外光 譜在 860.82 cm－1、930.09 cm－1的吸收峰，為α型葡聚糖的振動(dòng)光譜特征帶［10］，761.44 cm－1的吸收峰表明存在葡萄吡喃糖殘基，在1 730 cm－1左右沒有吸收峰表明不含糖醛酸。紅外分析結(jié)果表明PAP2是一種α－D-吡喃葡聚糖，與單糖組成分析結(jié)果一致。

圖5 黃傘子實(shí)體多糖純化組分PAP2的紅外光譜圖

2.5 PAP2的核磁共振波譜分析

黃傘子實(shí)體多糖PAP2的1H NMR如圖6所示。在PAP2的1H NMR譜圖中，異頭質(zhì)子的共振區(qū)域δ 4.6～5.5 ppm只存在一個(gè)異頭氫的共振峰δ 5.403，說明PAP2只有一種單糖組成，這與單糖組成分析結(jié)果一致，其質(zhì)子化學(xué)位移大于4.95，表明這些糖殘基為 α 型吡喃糖［11］。

圖6 黃傘子實(shí)體多糖純化組分PAP2的1H NMR譜圖(注:圖中吸收峰從左到右依次為 5.403、4.835、4.531、4.518、4.216、3.962、3.845、3.765、3.651、3.648、3.641、3.628、3.621、3.557、3.546、3.537、3.526、3.500、3.484、3.420、3.339、3.232ppm)

圖7 黃傘子實(shí)體多糖純化組分PAP2的13C NMR譜圖

黃傘子實(shí)體多糖PAP2的13C NMR譜如圖7所示。在PAP2的13C NMR譜圖中，低場區(qū)化學(xué)位移δ 99.652 ppm處的信號(hào)為葡萄糖殘基的異頭碳信號(hào)，由于化學(xué)位移小于δ 103，表明葡萄糖殘基的構(gòu)型為α吡喃型［12］，這與IR結(jié)果一致。在13C NMR譜中δ 99.652 ppm 處的位移，表明 C1 發(fā)生取代［13］;δ 76.543 ppm的信號(hào)表明糖鏈中存在C4位取代的葡萄糖殘基;δ 69.21 ppm附近的化學(xué)位移為6位取代的碳信號(hào)［14］;δ 62.346 ppm 處的強(qiáng)吸收峰說明大部分葡萄糖的C6未發(fā)生取代;在δ 82.5 ppm附近沒有吸收峰，表明C3沒有發(fā)生取代。根據(jù)峰高比例大致可以看出黃傘子實(shí)體多糖PAP2的主鏈為1-4糖苷鍵，存在1-6糖苷鍵的支鏈。

3 結(jié)論

通過熱水提取、sevag脫蛋白、活性炭脫色、柱層析等方法，首次從黃傘子實(shí)體中分離得到一種水溶性多糖組分PAP2，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步鑒定。經(jīng)HPGPC、HPLC-ESLD、IR、NMR 等方法分析，確定黃傘子實(shí)體純化多糖PAP2的分子質(zhì)量約為2.1×106u，由α-D吡喃葡萄糖殘基組成的葡聚糖，主鏈為1-4糖苷鍵，存在1-6糖苷鍵的支鏈。

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