草酸青霉液體發(fā)酵產(chǎn)果膠酶條件的優(yōu)化及其產(chǎn)物的酶學(xué)性質(zhì)

藍(lán)麗精,蔡琪敏,宋迤明,董夏夢,蔣冬花

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

果膠酶是分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱,最初是在桔子中提取出來的[1]。其主要來源于動植物及微生物,尤其是微生物,因具有生長速度快、生長條件簡單、代謝過程特殊等特征,成為果膠酶的重要來源[2],在食品工業(yè)、紡織工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等方面都有重大的應(yīng)用價(jià)值,是四大酶制劑之一[3]。目前中國果膠酶的生產(chǎn)主要采用固體發(fā)酵,但是固體發(fā)酵產(chǎn)生的雜蛋白較多,分離純化成本較高,回收率較低,其產(chǎn)品的質(zhì)量及產(chǎn)量較難達(dá)到食品行業(yè)的使用要求[4]。所以在液體發(fā)酵產(chǎn)果膠酶方面也有較多的研究,如Tari[5]采用Aspergillus sojae ATCC 20235液體發(fā)酵產(chǎn)果膠酶;尤華[6]利用Aspergillussp.XZ-131液體發(fā)酵產(chǎn)果膠酶,通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基,最終酶活達(dá)300 U/mL;楊欣偉等[7]利用E IM-6菌株通過響應(yīng)面法優(yōu)化了液體發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的條件,酶活提高了2.07倍。由于響應(yīng)面分析法可以對影響產(chǎn)量的因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評估,可以有效確定最佳生產(chǎn)條件,所以本研究在單因素的基礎(chǔ)上利用該方法對草酸青霉產(chǎn)果膠酶的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,得到最佳培養(yǎng)基配方,提高了果膠酶活性[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本實(shí)驗(yàn)室分離篩選獲得的高產(chǎn)果膠酶的草酸青霉(Penicillium oxalicum)L5菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①斜面一級種子培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA);②搖瓶種子培養(yǎng)基:果膠4 g,(NH4)2SO41 g,KH2PO43.8 g,K2HPO4·3H2O 0.2 g,水100 mL,pH 6.0;③搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基:桔皮粉4 g,米糠4 g,(NH4)2SO41 g,KH2PO43.8 g,K2HPO4·3H2O 0.2 g,水100 mL,pH 6.0。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng) 將經(jīng)PDA試管斜面培養(yǎng)后的菌株,用無菌水配成1.0×106個(gè)/mL孢子懸浮液,按5%的接種量(體積比)接入種子搖瓶培養(yǎng)基中,回轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速160 r/min,28℃,培養(yǎng)24 h后,取一定量的種子液接入搖瓶培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)70 h。裝液量均為250 mL三角瓶中裝40 mL。1.2.2 粗酶液的提取 發(fā)酵液在4℃,10 000 r/min離心10 min,取上清液作為粗酶液。

1.2.3 酶活測定 采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)法[9],規(guī)定每毫升果膠酶液降解果膠底物每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖為1個(gè)酶活單位。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基為配方,按照上述搖瓶培養(yǎng)的方法,分別以碳源、氮源、接種量及搖瓶初始pH為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測定果膠酶活性。

1.2.5 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[10]在單因素的基礎(chǔ)上,選擇影響較顯著的桔皮粉含量(A)、米糠含量(B)、硫酸銨含量(C)為響應(yīng)面的考察因素,以果膠酶產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值,采用Minitab 15軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,對液體發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。RS M實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

1.2.6 酶學(xué)特征[8]①反應(yīng)溫度對酶活的影響:將粗酶液分別置于30、40、50、60、70、80、90℃下測量其酶活;②熱穩(wěn)定性:將粗酶液分別在30、40、50、60、70℃溫水浴下保溫1、2、3、4 h后分別測定其酶活;③反應(yīng)pH對酶活的影響:配制pH 3.0～9.0的果膠底物溶液,分別測定在不同pH情況下的酶活;④pH穩(wěn)定性:將粗酶液分別在pH值為4.0～8.0的緩沖液中處理1、2、3、4 h,分別測定其酶活。

表1 RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors of response surface method and its level

2 結(jié)果與分析

2.1 液體發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的單因素實(shí)驗(yàn)

分別研究了添加不同的碳源(桔皮粉、柚子皮粉、香蕉皮粉等)和不同的碳源添加量;不同的氮源(硫酸銨、硫酸銨+米糠、米糠等)和不同的氮源添加量;接種量;搖瓶初始pH等對L5菌株液體發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的影響。結(jié)果顯示(圖1),在添加的碳源中,桔皮粉為最適碳源,添加量以5%為宜;在10種氮源中,添加復(fù)合氮源米糠+硫酸銨時(shí),果膠酶活最佳,此外,硫酸銨、蛋白胨和牛肉膏也是較適合的氮源,其中米糠的添加量為6%,硫酸銨的添加量為1%;接種量為9%時(shí)果膠酶產(chǎn)量最佳;較適宜的初始pH在6.0～8.0左右。

2.2 液體發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上,采用Minitab 15軟件,以桔皮粉含量、米糠含量、硫酸銨含量為自變量,果膠酶產(chǎn)量為響應(yīng)值設(shè)計(jì)RS M實(shí)驗(yàn),其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。最終擬合的回歸方程如下:Y=-460 130+138 200A+53 266.2B+46 168.1C-15 247.76A2-4 769.55B2-29 403.7C2+960.830AB+4 322.01AC-1 701.47BC。由表3、表4可知,回歸極顯著(P<0.001),失擬不顯著(P=0.241>0.05),該回歸方程高度顯著,能很好地對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測。在考察的因素中A、A2、B2、C2表現(xiàn)為極顯著(P<0.001),說明它們對響應(yīng)值的影響極大及其考察的因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的一次線性關(guān)系。

圖1 不同因素對果膠酶產(chǎn)量的影響Fig.1 The effect of different factors on the pectinase-producting

表2 RSM實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目及結(jié)果Table 2 The experimentproject and resultsofResponse surfacemethod

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of regression analysis

通過Minitab 15分析,繪制出等高線及曲面圖2～5,直觀地反映出了各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響,由圖可知各因素存在極點(diǎn)值。同時(shí),通過進(jìn)一步繪制優(yōu)化圖,得出產(chǎn)果膠酶的最佳條件:桔皮粉4.848 5%、米糠5.888 9%、硫酸銨0.974 7%,此時(shí)的果膠酶產(chǎn)量預(yù)測值為54 924.00 U。考慮到實(shí)際操作的現(xiàn)實(shí)性,將最佳條件修正為桔皮粉4.85%、米糠5.89%、硫酸銨0.97%,進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),得到的果膠酶產(chǎn)量分別為54 964.29、53 246.53、54 964.29 U,平均產(chǎn)量為54 391.70 U,與預(yù)測產(chǎn)量無顯著差別,證明此次RS M實(shí)驗(yàn)參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

圖2 果膠酶產(chǎn)量與米糠、硫酸銨的等值線及曲面圖Fig.2 The isogram and surface chart of pectinase-producting on rice bran and(NH4)2SO4

圖3 果膠酶產(chǎn)量與桔皮粉、硫酸銨的等值線及曲面圖Fig.3 The isogram and surface chart of pectinase-producting on citrus peel powder and(NH4)2SO4

圖4 果膠酶產(chǎn)量與桔皮粉、米糠的等值線及曲面圖Fig.4 The isogram and surface chart of pectinase-producting on citrus peel powder and rice bran

圖5 果膠酶產(chǎn)量與桔皮粉、米糠、硫酸銨的優(yōu)化圖Fig.5 The optimization figure of pectinase-producting on citrus peel powder,rice bran and(NH4)2SO4

2.3 酶學(xué)特性

2.3.1 反應(yīng)溫度對酶活的影響及其熱穩(wěn)定性圖6A可知,當(dāng)反應(yīng)溫度為30～50℃時(shí),酶活上升;反應(yīng)溫度為50～90℃時(shí),酶活下降。由圖6C可知,酶在30～50℃時(shí)有較好的熱穩(wěn)定性,并且在此范圍內(nèi),溫度在50℃時(shí),酶活達(dá)最大值。

2.3.2 反應(yīng)pH對酶活的影響及其熱穩(wěn)定性圖6B顯示,在pH范圍為3.0～5.0時(shí),酶活隨著酶作用的底物pH增大而上升;在pH范圍為5.0～9.0時(shí),酶活隨著酶作用底物pH的增大而下降。由圖6D可見,酶在pH值為4.0～6.0的范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性,pH值為5.0時(shí)穩(wěn)定性最佳,并且當(dāng)?shù)孜飌H為5.0時(shí)酶活力達(dá)到最大值。

圖6 L5菌株的酶學(xué)性質(zhì)Fig.6 The enzymatic properties ofL5

3 討 論

在碳源篩選過程中選擇了多種果皮粉及可溶性糖類,結(jié)果表明桔皮粉等含果膠的有機(jī)物質(zhì)作為碳源時(shí)促進(jìn)產(chǎn)酶;而葡萄糖等可溶性糖類作為碳源時(shí),酶活較低,可能是因?yàn)槠浞纸猱a(chǎn)物阻遏了酶的合成[11]。桔皮粉作為碳源的同時(shí),又作為誘導(dǎo)劑,促進(jìn)了酶的合成[12]。氮源的篩選結(jié)果表明,同時(shí)添加無機(jī)氮源(NH4)2SO4和有機(jī)氮源米糠時(shí)更有利于酶的合成。其中米糠主要起到持效氮源的作用,硫酸銨則起到速效氮源的作用,這樣的組合更有利于草酸青霉持續(xù)快速的生長和發(fā)育[7]。

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)及RS M優(yōu)化,得到該菌株在桔皮粉4.85 g,米糠5.89 g,(NH4)2SO40.97 g,KH2PO43.8 g,K2HPO4·3H2O 0.2 g,水100 mL,初始pH 6.0,溫度28℃,搖床轉(zhuǎn)速160 r/min,接種量9%,培養(yǎng)70 h時(shí)酶活最高,最終可達(dá)54 391.70 U,較原來提高了3倍。在草酸青霉液體發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的研究中處于較高水平。

對草酸青霉菌株在液體發(fā)酵提取液中果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了探討,結(jié)果顯示該酶的最適反應(yīng)溫度為50℃,最適反應(yīng)pH為5.0,在30～50℃時(shí)有較好的熱穩(wěn)定性,在pH值為4.0～6.0的范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性,pH值為5.0時(shí)穩(wěn)定性最佳。與彭霞薇等[13]對草酸青霉BZH_2002果膠酶酶特性的研究結(jié)果略有不同。

本研究的菌株利用浙江來源豐富的桔皮和米糠作為搖瓶培養(yǎng)基,不僅實(shí)現(xiàn)了廢物再利用,同時(shí)可以使其高產(chǎn),可見對該菌株的研究具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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