不同海水濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)海洋真菌抗菌活性的影響

杜希萍，楊玖欽，楊秋明，伍菱，鄭忠輝，蘇文金，*

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門361021;2.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與腫瘤細(xì)胞工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室福建省藥物工程實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361005)

海洋中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，其特殊復(fù)雜的海洋環(huán)境(高鹽度、高壓力、低溫、特殊光照、寡營(yíng)養(yǎng)等)賦予海洋微生物特殊的代謝方式，代謝物化學(xué)結(jié)構(gòu)具有極大的復(fù)雜性和多樣性［1］。不少研究也表明，原來(lái)分離自海洋動(dòng)植物的活性物質(zhì)是與其共生的微生物產(chǎn)生的［2-5］。此外，海洋微生物具有繁殖快、易培養(yǎng)、代謝易于調(diào)控，菌種較易選育等優(yōu)點(diǎn)，可以結(jié)合現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，既降低海洋藥物的生產(chǎn)成本，又無(wú)藥源之憂。因此，目前國(guó)際許多大制藥企業(yè)已投資海洋微生物實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)，以優(yōu)化培養(yǎng)條件達(dá)到高產(chǎn)定向培養(yǎng)生物活性物質(zhì)的目的。海洋真菌是海洋微生物的一個(gè)重要分支，Schiehser等［6］報(bào)道了第一個(gè)從海洋真菌中分離的有抗菌活性的天然產(chǎn)物L(fēng)eptosphaerin。近年來(lái)，隨著對(duì)海洋真菌研究的深入，已從中發(fā)現(xiàn)許多結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的化合物，包括抗腫瘤、抗病毒、抗菌化合物，細(xì)胞周期抑制劑、酶抑制劑等［7-12］。本文通過(guò)研究不同海水濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)海洋真菌抗菌活性的影響，旨在提高發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)的幾率，為大規(guī)模發(fā)酵海洋真菌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源10株海洋真菌(zl01a-2、ty03b-11、ty03b-8、ty03b-1、ty01a-7、zl01a-9、zl01a-11、zl03b-2、zl03b-5、zl04b-4)為廈門大學(xué)微生物藥物學(xué)課題組保存菌種。

1.1.2 指示菌金黃色葡萄球菌CMCC26003(Staphylococcus aureus CMCC26003，SA)、短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus，BP)、枯草芽胞桿菌CMCC63501(Bacillus subtilis CMCC63501，BS)。

1.1.3 培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PD/PDA)：馬鈴薯200 g(去皮，切成小塊，加水煮沸30 min，4～6層紗布過(guò)濾，收集濾液)，葡萄糖20 g，用不同濃度的海水(0%、20%、50%、80%和100%)定容至1 000 mL;固體培養(yǎng)基則加2%瓊脂，121℃高壓滅菌20 min;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化從斜面挑取菌絲塊分別接種于50%海水PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)4 d。1.2.2菌株的固體發(fā)酵挑取活化后菌株的菌絲塊分別接種于海水濃度為0%、20%、50%、80%、100%的PDA培養(yǎng)基平板上，每個(gè)海水濃度發(fā)酵100 mL，28℃培養(yǎng)20 d。

1.2.3 菌株的液體發(fā)酵挑取活化后菌株的菌絲塊分別接種于海水濃度為50%的PD培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株發(fā)酵200 mL，180 r/min，28℃分別培養(yǎng)7 d和14 d。

1.2.4 固體發(fā)酵產(chǎn)物的提取將固體發(fā)酵產(chǎn)物切成小塊，用乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸(80∶15∶5)混合溶劑浸提3次，合并提取液于45℃減壓濃縮至干，稱量后用甲醇稀釋備用。

1.2.5 液體發(fā)酵產(chǎn)物的提取液體發(fā)酵產(chǎn)物用4層紗布過(guò)濾，得到發(fā)酵液上清和菌體。發(fā)酵液上清用等體積乙酸乙酯萃取2次，合并有機(jī)相減壓濃縮至干，稱量后用甲醇稀釋備用。

1.2.6 抗菌活性測(cè)定用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定發(fā)酵提取物的抗菌活性［13］。加入適量指示菌菌懸液于冷卻至45℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，迅速搖勻(終濃度為105cfu/mL)，傾注法制成平板待用。用微量進(jìn)樣器吸取含300 μg發(fā)酵提取物的稀釋液滴加于已滅菌的濾紙片上，待溶劑揮干后，將含樣品的濾紙片貼于瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 海水濃度對(duì)抗菌活性的影響

在供試的10株海洋真菌中，5株海洋真菌的抗菌活性受海水濃度的影響較大。從圖1可以看出，當(dāng)海水濃度為0%、20%、50%和80%時(shí)，菌株zl03b-5對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和(或)短小芽胞桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性;而海水濃度為100%時(shí)，菌株zl03b-5僅對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出抗菌活性，抑菌圈為6 mm。

圖1 菌株zl03b-5的抗菌活性Fig.1 Antimicrobial activity of zl03b-5

當(dāng)海水濃度為0%時(shí)，菌株zl01a-2表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌、短小芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌的抑菌圈分別為14、8和17 mm;當(dāng)海水濃度為20%和50%時(shí)，菌株zl01a-2表現(xiàn)出相似的抗菌活性，對(duì)短小芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌的抑菌圈均為8 mm;而海水濃度為80%和100%時(shí)，菌株zl01a-2表現(xiàn)出最弱的抗菌活性，對(duì)短小芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌的抑菌圈均為7 mm(表1)。

表1 菌株zl01a-2的抗菌活性Table 1 Antimicrobial activity of zl01a-2

從表2可以看出，當(dāng)海水濃度為0%、20%和100%時(shí)，菌株zl04b-4對(duì)指示菌具有抗性，而海水濃度為50%和80%時(shí)，菌株zl04b-4對(duì)3種指示菌均沒(méi)有抗性。

表2 菌株zl04b-4的抗菌活性Table 2 Antimicrobial activity of zl04b-4

菌株ty03b-11和zl03b-2對(duì)短小芽胞桿菌的抗性受海水濃度的影響不大，而對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的抗性受海水濃度的影響較大。當(dāng)海水濃度為0%時(shí)，菌株ty03b-11和zl03b-2對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為0、14 mm;而海水濃度為80%時(shí)，其抑菌圈分別為9、17 mm;海水濃度為50%時(shí)，菌株ty03b-11和zl03b-2對(duì)枯草芽胞桿菌均表現(xiàn)出最弱的抗性(表3和表4)。

表3 菌株ty03b-11的抗菌活性Table 3 Antimicrobial activity of ty03b-11

表4 菌株zl03b-2的抗菌活性Table 4 Antimicrobial activity of zl03b-2

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抗菌活性的影響

在供試的10株海洋真菌中，6株海洋真菌的抗菌活性受培養(yǎng)時(shí)間的影響顯著。表5的結(jié)果表明，菌株zl03b-2、ty01a-7和zl01a-2培養(yǎng)14 d時(shí)抗菌活性較好，而菌株zl04b-4培養(yǎng)14 d時(shí)對(duì)3種指示菌均沒(méi)有抗性，培養(yǎng)7 d時(shí)能抑制枯草芽胞桿菌的生長(zhǎng)，其抑菌圈為14 mm。菌株ty03b-11和zl03b-5的抗菌活性不僅與培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)，而且與指示菌種類的關(guān)系很大。培養(yǎng)7 d時(shí)，ty03b-11對(duì)金黃色葡萄球菌、短小芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌的抑菌圈分別為15、8和7 mm;而培養(yǎng)14 d時(shí)，其抑菌圈分別為12、10和14 mm。培養(yǎng)7 d時(shí)，zl03b-5對(duì)金黃色葡萄球菌、短小芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌的抑菌圈分別為7、9和17 mm;而培養(yǎng)14 d時(shí)，其抑菌圈分別為6、9和10 mm。

表5 培養(yǎng)7 d和14 d時(shí)海洋真菌的抗菌活性Table 5 Antimicrobial activity of marine fungi harvested at 7 days and 14 days

3 討論

不同海水濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)海洋真菌抗菌活性的影響國(guó)內(nèi)外已有一些報(bào)道。如Bugni等［14］對(duì)9株海洋真菌進(jìn)行了發(fā)酵條件的研究。發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)enicillium brocae(F97S76)培養(yǎng)10 d時(shí)，人工海水比例為20%～60%的抽提物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)表現(xiàn)出抗性;而人工海水比例為80%和100%的抽提物對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)表現(xiàn)出抗性，表明人工海水濃度變化時(shí)，代謝產(chǎn)物的類型也發(fā)生了變化;菌株P(guān)enicillum sp.(F97I21)表現(xiàn)出人工海水濃度與抗菌活性具有極大的關(guān)系，當(dāng)人工海水比例為20%～40%時(shí)活性物質(zhì)的產(chǎn)量較高。Masuma等［15］研究了不同海水濃度對(duì)海洋真菌菌絲生長(zhǎng)及抗菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)3株海洋真菌的抗菌活性隨著海水濃度的增加而增加，表明它們更適應(yīng)海洋環(huán)境。郭江等［16］發(fā)現(xiàn)海洋真菌菌株M-401對(duì)藤黃八疊球菌抑菌效果最好培養(yǎng)時(shí)間是在48 h，而對(duì)大腸埃希菌抑菌效果最好培養(yǎng)時(shí)間是在72 h。

本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，海水濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)海洋真菌的抗菌活性具有顯著影響。海水濃度和培養(yǎng)時(shí)間不同，抗菌物質(zhì)的種類和產(chǎn)量可能有較大差別。菌株zl03b-5和zl01a-2在海水濃度為0%時(shí)具有較強(qiáng)的抗菌活性，而海水濃度為100%時(shí)的抗菌活性較弱(圖1和表1)，表明它們可能來(lái)源于陸地或淡水，不屬于專性海洋真菌，而屬于兼性海洋真菌。菌株zl04b-4在海水濃度為0%、20%和100%時(shí)具有抗菌活性，而海水濃度為50%和80%時(shí)沒(méi)有抗菌活性(表2)，表明zl04b-4可能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)用于滲透調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)特殊的高鹽環(huán)境。菌株zl03b-2、ty01a-7和zl01a-2培養(yǎng)14 d時(shí)具有較強(qiáng)的抑菌作用，表明其抗菌活性物質(zhì)可能來(lái)源于初級(jí)代謝產(chǎn)物;而菌株zl04b-4培養(yǎng)14 d時(shí)沒(méi)有抑菌作用，培養(yǎng)7 d時(shí)能抑制枯草芽胞桿菌的生長(zhǎng)，表明其抗菌活性物質(zhì)可能來(lái)源于次級(jí)代謝產(chǎn)物，抗菌活性物質(zhì)的化合物類型有待進(jìn)一步研究。

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