低濕度培養(yǎng)誘生變形桿菌復(fù)雜群集運(yùn)動增殖生長模式

劉艷霞，劉蕾，劉俊康，鄧渝

(第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗系生物波研究中心，重慶400038)

變形桿菌(Proteus mirabilis)被用作模擬微生物和其他復(fù)雜自身機(jī)化系統(tǒng)(self-organizing systems)的模式系統(tǒng)(model system)，同時變形桿菌也是一種生物系統(tǒng)實例，在該生物系統(tǒng)中，局部動力-分期結(jié)構(gòu)決定系統(tǒng)的立體動力。對變形桿菌的研究與其他系統(tǒng)有相似的關(guān)聯(lián)性，如腫瘤生長，以及年齡、體積、腫瘤和免疫細(xì)胞的激活水平等生理學(xué)構(gòu)造和過程，對評價系統(tǒng)空間行為具有重要作用［1］。本研究探討低濕度培養(yǎng)環(huán)境對變形桿菌集群運(yùn)動生長模式的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株奇異變形桿菌(Proteus mirabilis，PM)由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，各成分溶于蒸餾水，調(diào)pH至7.2～7.4，加入2.5%瓊脂，高壓滅菌。臨用前加入0.05%三苯基四氮唑(TTC)及0.1%葡萄糖，制成平板。

1.2 方法

1.2.1 平板含水量測定將已經(jīng)高壓滅菌的LB培養(yǎng)基溶化，待其溫度降至50℃左右按比例加入TTC、葡萄糖混勻，制板，室溫冷凝，37℃、倒置、敞口烤板，0 h稱重(M0)、0.5 h稱重(M0.5)、2.5 h稱重(M2.5)，2.5 h后37℃、正置、敞口烤板至干，恒重后稱重(M∝)，設(shè)0 h含水量(H)為100%，計算0.5 h及2.5 h的平板相對含水量：

1.2.2 低濕度誘導(dǎo)培養(yǎng)將已經(jīng)高壓滅菌的LB培養(yǎng)基溶化，待其溫度降至50℃左右按比例加入TTC、葡萄糖混勻，制板，室溫冷凝，37℃倒置、敞口、無菌烤板2.5 h，中心點種奇異變形桿菌37℃培養(yǎng)3 d。平行培養(yǎng)3皿。

1.2.3 不同區(qū)域菌體傳代培養(yǎng)如1.2.1方法制備培養(yǎng)平板，37℃倒置、敞口、無菌0.5 h，同一平板中對稱點種外環(huán)菌與內(nèi)環(huán)菌37℃培養(yǎng)24 h。連續(xù)培養(yǎng)3代，計算菌落直徑比值反應(yīng)集群運(yùn)動增殖速率差異。

1.2.4 不同區(qū)域菌體革蘭染色取培養(yǎng)24 h的第3代菌的最外沿菌體，涂片固定，草酸銨結(jié)晶紫染色1 min，自來水沖洗，加碘液覆蓋涂面染色1 min，水洗，吸水紙吸去水分，加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進(jìn)行脫色，30 s后水洗，吸去水分，蕃紅染色液(稀)染色10 s后，自來水沖洗，干燥，油鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板含水量測定結(jié)果

平板含水量測定結(jié)果見表1。

表1 平板含水量測定結(jié)果Table 1 Flat water content results

2.2 奇異變形桿菌在低濕度培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)觀察結(jié)果

初始階段同賈雄飛等［2］報道的方式增殖，色環(huán)間距、環(huán)擴(kuò)增時間小于其報道，后出現(xiàn)環(huán)間距增大的菌群(圖1)。環(huán)間距小的為內(nèi)環(huán)菌，間距大的為外環(huán)菌。

圖1 低濕度誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果Fig.1 Result of low humidity induced culture

2.3 不同區(qū)域菌體傳代培養(yǎng)觀察結(jié)果

由菌落直徑可見，內(nèi)環(huán)菌菌落直徑較小，外環(huán)菌菌落直徑較大(圖2)，顯示出不同的增殖和遷移能力。菌落直徑比值見表2，可見外環(huán)菌集群運(yùn)動增殖速率大于內(nèi)環(huán)菌，且有隨著培養(yǎng)代數(shù)增多差異增大的趨勢。

圖2 不同區(qū)域菌體傳代培養(yǎng)觀察結(jié)果Fig.2 Results of different regions of the cell subculture

表2 菌落直徑比值(ˉ±SD，n=9)Table 2 The ratio of colony diameter(ˉ±SD，n=9)

表2 菌落直徑比值(ˉ±SD，n=9)Table 2 The ratio of colony diameter(ˉ±SD，n=9)

注：*P＜0.01與第1代比較

第1代第2代第3代菌落直徑比1.83±0.173.71±0.12*4.51±0.12*

2.4 不同區(qū)域菌體革蘭染色結(jié)果

革蘭染色結(jié)果(圖3)顯示內(nèi)環(huán)菌與外環(huán)菌均為革蘭陰性菌，內(nèi)環(huán)菌短桿狀居多，外環(huán)菌菌體長桿狀或絲狀居多。

圖3 不同區(qū)域菌體革蘭染色結(jié)果(1 000×)Fig.3 Gram stain results of different regions of the bacterial(1 000×)

3 討論

對變形桿菌的研究與腫瘤生長等系統(tǒng)及年齡、體積、腫瘤和免疫細(xì)胞的激活水平等生理學(xué)構(gòu)造和過程有相似的關(guān)聯(lián)性，對評價系統(tǒng)空間行為具有重要作用。Bruce P.Ayati［1］在Esipov和Shapiro提出的變形桿菌細(xì)胞周期動力學(xué)的數(shù)學(xué)描述的基礎(chǔ)上，提出一種分期和空間上連續(xù)的結(jié)構(gòu)模型，計算變形桿菌的群體增殖生長，反應(yīng)實驗中觀察到的時間和空間上的規(guī)律性。

本研究室在研究中發(fā)現(xiàn)，改變培養(yǎng)環(huán)境可影響變形桿菌的集群增殖生長模式，直觀反應(yīng)環(huán)境對系統(tǒng)的影響。Howard C.Berg［3］指出鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)在營養(yǎng)豐富的軟瓊脂表面菌體延長，生長出更多的鞭毛，并以協(xié)同運(yùn)

動的方式布滿瓊脂表面，當(dāng)瓊脂表面干燥時，鞭毛分泌的由抗δ因子控制的鞭毛合成晚期基因分泌減少，菌體的鞭毛短，集群運(yùn)動性減弱。本研究探討低濕度對變形桿菌集群運(yùn)動增殖生長模式的影響，結(jié)果表明低濕度環(huán)境不利于變形桿菌的集群運(yùn)動增殖，同時又可誘生出高遷移能力的菌體，從而使其群集增殖生長模式復(fù)雜化，直觀反映了一種環(huán)境變化即可對系統(tǒng)產(chǎn)生巨大的影響。

［1］ Ayati BP.A structured-population model of Proteus mirabilis swarm-colony development［J］.J Math Biol，2006，52(1)：93-114.

［2］ 賈雄飛，劉俊康，徐啟旺.奇異變形桿菌周期性群集運(yùn)動的研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，27(9)：868-870.

［3］ Berg HC.Swarming motility：it better be wet［J］.Curr Biol 2005，15(15)：R599-600.