SN38對Fas介導(dǎo)凋亡效應(yīng)的影響

曹妍，王歡，童曉鵬，單風(fēng)平，梅原久範(fàn)，呂昌龍*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽110001;2.西藏民族學(xué)院免疫學(xué)教研室，陜西咸陽712000;3.金沢醫(yī)科大學(xué)血液免疫內(nèi)科，日本金沢920-0293)

細(xì)胞凋亡是在多種基因調(diào)控下的一個嚴(yán)密完整的、主動的、有序的死亡過程。Fas(CD95/APO-1)是TNF受體超家族成員，通過與Fas配體(FasL)或者抗Fas抗體(CH11)結(jié)合，誘導(dǎo)Fas分子聚集形成三聚體，通過其胞漿內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)與Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)蛋白(Fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD)結(jié)合，形成死亡受體誘導(dǎo)的信號復(fù)合體(DISC)，DISC可以活化caspase分子介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［1］。伊立替康(Irinotecan)，也稱為CPT-11，通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ，TopoⅠ)選擇性殺傷S期細(xì)胞。SN38(10-hydroxy-7-ethyl-camptothe-cin)是CPT-11的活性代謝產(chǎn)物，其作用強度至少是CPT-11的1 000倍，并且具有廣泛的抗腫瘤譜［2-3］。脂筏是細(xì)胞膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域(microdomain)。鞘磷脂(sphingomyelin，SM)是脂筏的重要組成成分。最近的一些研究表明，F(xiàn)as介導(dǎo)的凋亡過程中，F(xiàn)as可易位和聚集于脂筏所在區(qū)域［4］，脂筏通過促進DISC的形成進而活化caspase依賴的細(xì)胞死亡途徑。因此為深入探討SN38與Fas介導(dǎo)凋亡的相互關(guān)系，本實驗通過單獨應(yīng)用SN38或SN38聯(lián)合CH11(Fas抗體)作用于脂筏陰性和脂筏陽性的T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株WR/Fas-SM(-)細(xì)胞和WR/Fas-SMS1細(xì)胞，觀察SN38能否促進Fas介導(dǎo)的凋亡以及對2種細(xì)胞的效應(yīng)差異，并進一步探討脂筏在該過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞WR/Fas-SMS1細(xì)胞和WR/Fas-SM(-)細(xì)胞［5］由日本金沢醫(yī)科大學(xué)血液免疫內(nèi)科提供。

1.1.2 主要試劑二甲基亞砜(DMSO，SIGMAALDRICH);0.4%臺盼藍(Gibco);碘化丙啶(PI，Invitrogen);多聚甲醛;皂甙;瓊脂糖(TAKARA);RPMI-1640培養(yǎng)液500 mL(Gibco，Invitrogen);CH11(Medical＆Biological Laboratories，Japan);Genelute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit(Sigma);SN38(Yakult pharmaceutical，Japan)。

1.1.3 主要儀器流式細(xì)胞儀，F(xiàn)ACSCalibur，美國BD公司;CO2細(xì)胞孵育箱，WJ-3，日本Harasawa;倒置顯微鏡，日本Olympus。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)WR/Fas-SM(-)細(xì)胞和WR/Fas-SMS1細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)液中，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞處理常規(guī)收集并且計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，接種24孔板，每孔1 mL。CO2細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)2 h后，分別加入不同濃度SN38和/或CH11刺激，混勻細(xì)胞后，放入CO2細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察刺激細(xì)胞12 h后，于倒置顯微鏡下觀察，并于放大400倍時拍照記錄。

1.2.4 FACS檢測細(xì)胞凋亡分別收集24孔板中處理后的WR/Fas-SM(-)細(xì)胞和WR/Fas-SMS1細(xì)胞于1.5 mL微量離心管中，1 200 r/min離心3 min，棄上清，每管加0.5%PFS(0.5%多聚甲醛，0.5%皂甙)100 μL，再加入150 μg/mL RNase A 50 μL。室溫放置30 min后，每管加入1 mL PBS，混勻后，1 200 r/min離心3 min，棄上清，每管留50 μL液體，再加入200 μg/mL PI 5 μL，混勻后避光放置15 min。再于每管加入500 μL PBS，待流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 DNA ladder檢測按照Sigma Genelute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit說明書操作。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)分析軟件，用t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 SN38對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1凋亡的影響

WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1經(jīng)過不同濃度SN38刺激12 h后，與對照組相比不同濃度SN38均誘導(dǎo)了2種細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象發(fā)生，但在各濃度組，2種細(xì)胞之間的凋亡率并無顯著性差異，見圖1。

2.2 CH11對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1凋亡的影響

WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1經(jīng)過不同濃度CH11刺激3 h后，50 ng/mL CH11可誘導(dǎo)WR/Fas-SM(-)細(xì)胞有意義的凋亡現(xiàn)象，但凋亡率較低;而在25 ng/mL和50 ng/mL 2個濃度組均誘導(dǎo)了WR/Fas-SMS1細(xì)胞有統(tǒng)計學(xué)意義的凋亡現(xiàn)象，并且在2個濃度組，2細(xì)胞之間的凋亡率存在顯著性差異，見圖2。

圖2 CH11作用WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1后凋亡率的比較Fig.2 Comparision of apoptosis between WR/Fas-SM(-)and WR/Fas-SMS1 cultured with CH11

2.3 SN38和CH11共同作用對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1凋亡的影響

圖3 SN38單獨及與CH11聯(lián)合應(yīng)用對WR/Fas-SM(－)細(xì)胞凋亡率的影響比較Fig.3 Comparision of apoptosis of WR/FAS-SM(-)cultured with CH11 and/or SN38

SN38和CH11聯(lián)合應(yīng)用與SN38單獨應(yīng)用各濃度組相比，WR/Fas-SM(-)細(xì)胞凋亡率未見顯著性差異(見圖3);但對WR/Fas-SMS1細(xì)胞，在SN38 50 nmol/L濃度組出現(xiàn)凋亡率的差異(見圖4)，并且在該濃度組，2種細(xì)胞之間的凋亡率出現(xiàn)了顯著性差異(見圖5)。

圖4 SN38單獨及與CH11聯(lián)合應(yīng)用對WR/Fas-SMS1細(xì)胞凋亡率的影響比較Fig.4 Comparision of apoptosis of WR/Fas-SMS1 cultured with CH11 and/or SN38

圖5 SN38和CH11共同作用對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1凋亡率的影響比較Fig.5 Comparision of apoptosis between WR/Fas-SM(-)and WR/Fas-SMS1 cultured with CH11 and SN38

2.4 SN38和CH11共同作用后WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1的形態(tài)學(xué)改變

WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1經(jīng)過SN38和CH11刺激12 h后均出現(xiàn)比較明顯的凋亡現(xiàn)象，并且WR/Fas-SMS1細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于WR/Fas-SM(-)細(xì)胞，見圖6(圖中箭頭所指為凋亡細(xì)胞)。

圖6 SN38和CH11共同作用對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1的形態(tài)學(xué)改變(400×)Fig.6 Morphological changes of WR/Fas-SM(-)and WR/Fas-SMS1 after SN38 and CH11 stimulation(400×)

2.5 SN38和CH11共同作用對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1 DNA降解的影響

WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1經(jīng)過SN38和CH11刺激12 h后，DNA提取結(jié)果經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果表明2種細(xì)胞都出現(xiàn)了DNA的斷裂片段呈梯狀(DNA ladder)排列，并且WR/Fas-SMS1細(xì)胞DNA的斷裂程度明顯強于WR/Fas-SM(-)細(xì)胞，見圖7。

圖7 SN38和CH11共同作用對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1 DNA降解的影響Fig.7 Degradation of chromosomal DNA in WR/Fas-SM(-)and WR/Fas-SMS1 after SN38 and CH11 stimulation

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，聯(lián)合應(yīng)用SN38和CH11與單獨應(yīng)用SN38或CH11相比，能夠誘導(dǎo)WR/Fas-SMS1細(xì)胞更強的凋亡。該結(jié)果表明化療藥SN38與CH11聯(lián)合使用在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用中具有疊加效應(yīng)。

脂筏是細(xì)胞膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域，參與細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運、信號傳導(dǎo)過程［6］。信號分子(如受體)將在脂筏中與它們的配體相遇，啟動信號傳遞途徑［7-8］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，脂筏參與了免疫突觸的形成［9］，巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用［10］，老年癡呆病中淀粉樣蛋白的產(chǎn)生［11］等一系列生理和病理過程。鞘磷脂是脂筏的重要組成成分。目前，人們已經(jīng)成功克隆了2種編碼SMS的基因，分別為SMS1和SMS2。本實驗中所應(yīng)用的WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1細(xì)胞分別是SMS1缺陷和表達的2株細(xì)胞，進而形成了細(xì)胞膜脂筏陰性和陽性的2種細(xì)胞。最近的一些實驗表明，脂筏參與了Fas介導(dǎo)的凋亡過程，尤其是在多發(fā)性骨髓瘤［12］和淋巴瘤［13］的發(fā)病過程中。

單獨應(yīng)用不同濃度SN38作用于WR/Fas-SM(-)細(xì)胞和WR/Fas-SMS1細(xì)胞后，各濃度組的凋亡率在2種細(xì)胞間均未見顯著性差異，且在50 nmol/L濃度的SN38刺激時，相比25 nmol/L濃度并不能誘導(dǎo)出更高的凋亡率;而在SN38與25 ng/mL的CH11共同作用于2種細(xì)胞后，觀察到在SN38為50 nmol/L時明顯誘導(dǎo)了WR/Fas-SMS1細(xì)胞更高的凋亡率，而對WR/Fas-SM(-)細(xì)胞相同的處理后，并沒有該現(xiàn)象的發(fā)生。隨后的形態(tài)學(xué)觀察和DNA Ladder的實驗結(jié)果也更加證實了這個結(jié)論。由于WR/Fas-SMS1細(xì)胞含有人為轉(zhuǎn)入的SMS1基因，因此該細(xì)胞膜表面表達SM，而對于WR/Fas-SM(-)細(xì)胞，由于SM缺陷，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂筏功能的缺陷或低下。又由于脂筏參與Fas介導(dǎo)凋亡過程，即參與了Fas與配體結(jié)合后，信號向內(nèi)部的傳遞［14］，甚至有些實驗表明，在細(xì)胞膜存在脂筏的情況下，F(xiàn)as可以在沒有Fas配體與其結(jié)合的情況下介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15］?；谝陨辖Y(jié)果，可推測脂筏在SN38和CH11共同作用后，2種細(xì)胞凋亡率的顯著差異中起到了決定性的作用。

綜上，SN38和CH11的共同應(yīng)用能促進WR/Fas-SMS1細(xì)胞的凋亡，顯示了SN38和CH11在誘導(dǎo)凋亡方面的協(xié)同作用。同時，SN38和CH11的共同應(yīng)用對WR/Fas-SM(-)細(xì)胞凋亡的促進不明顯，推測脂筏在SN38促進WR/Fas-SMS1細(xì)胞Fas介導(dǎo)凋亡作用中起到一定作用。

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