不同巢材鳥巢中優(yōu)勢菌群的分離鑒定

朱春玉，徐劍，萬冬梅，李輝，霍雅鵬

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院遼寧省動物資源與疫病防治重點實驗室，遼寧沈陽110036)

鳥類的活動范圍大，很容易受到一些病原微生物感染并將其大范圍地傳播。鳥類疾病通常由細菌、病毒、真菌和寄生蟲等病原體引起。這些病原微生物對鳥類自身種群、生境周圍的人和家養(yǎng)動物都構(gòu)成潛在的威脅。而且疾病會對鳥類的身體、生理、繁殖能力、行為及其他方面造成功能障礙，影響鳥類的健康，從而降低其存活能力［1］。因此研究不同環(huán)境鳥類伴生致病菌為鳥類疾病的監(jiān)測和防治，野生動物、家養(yǎng)動物與人共患傳染病的研究，提供一些基本的科學(xué)依據(jù)。鳥巢是鳥類在繁殖期產(chǎn)卵、孵化直至雛鳥離巢而選擇或筑造的一種臨時性結(jié)構(gòu)，對鳥類的繁殖具有極其重要的意義，探討鳥類在筑巢選材上的規(guī)律有助于了解鳥類的繁殖生物學(xué)特性。鳥類在對巢材的選擇上具有多樣性，觀察發(fā)現(xiàn)有很多鳥類選擇蘚類植物作為巢材。例如，Campbell＆Ferguson(1972)報道了英國常見鳥類中有53種利用蘚類植物筑巢;Breil＆Moyle(1976)分析了9種鳥的巢，發(fā)現(xiàn)其中的蘚類植物多達60種。周艷等［2］對北京地區(qū)4種雀形目鳥類鳥巢中的蘚類植物進行了分析，發(fā)現(xiàn)巢材組成中共有7種蘚類植物。杜楊等［3］報道分布在遼寧地區(qū)的雜色山雀主要以7科8屬的蘚類植物作為巢材。為什么這么多的鳥類尤其是洞巢鳥類選擇蘚類植物作為巢材?本研究擬從不同巢材的鳥巢中優(yōu)勢菌群的差異角度探索蘚類植物在鳥類繁殖中的意義，此類研究在國內(nèi)外鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料苔蘚類巢材和對照巢材草葉巢材各5份，均取自遼寧仙人洞國家級自然保護區(qū)懸掛的鳥類人工巢箱中。

1.1.2 試劑牛肉膏、蛋白胨和瓊脂均購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司;蛋白酶K、溶菌酶、DNA Taq聚合酶和2 000 bp ladder Marker均購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 巢材微生物分離菌種分離所用培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨和高氏一號培養(yǎng)基。將制備好的平板培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中1～2 d后檢查，確認沒有污染方可使用。然后采用稀釋法分離培養(yǎng)。即分別稱取巢材5 g，置于盛有90 mL無菌水的150 mL三角瓶中，于200 r/min的振蕩器上振蕩10～15 min，使巢材均勻分散，靜止數(shù)分鐘，在超凈工作臺上，吸取1 mL懸浮液置于9 mL滅菌水中稀釋得10倍液，依次按10倍法稀釋，稀釋到10-6成一系列稀釋液。試驗前取不同濃度梯度、不同取樣量進行預(yù)試，每個處理重復(fù)3次，根據(jù)預(yù)試結(jié)果，確定各巢材樣細菌、放線菌適宜稀釋梯度和接種量。各種菌接種后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～15 d后檢查結(jié)果，統(tǒng)計各微生物的數(shù)量。

1.2.2 不同巢材優(yōu)勢細菌與放線菌的分離純化

將1.2.1分離培養(yǎng)的細菌計數(shù)后，根據(jù)細菌菌落的形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)性狀對細菌進行初步歸類并統(tǒng)計其數(shù)量，在10-1～10-6濃度梯度平板中均出現(xiàn)菌落數(shù)比率大于25%的菌株，確定為優(yōu)勢細菌［4］。挑取優(yōu)勢細菌單菌落進行純化保存，并統(tǒng)一編號為CX1、CX2、CX3...TX1、TX2、TX3...(其中，CX表示草葉巢材中分離出的優(yōu)勢細菌;TX表示從苔蘚巢材中分離得到的優(yōu)勢細菌);將分離純化后的放線菌菌株統(tǒng)一編號為：TF1、TF2、TF3...CF1、CF2、CF3...(CF表示草葉巢材中分離出的放線菌，TF表示苔蘚巢材中分離出的放線菌)。將所有優(yōu)勢菌株編號后進行保存，待進一步鑒定。

1.2.3 不同巢材優(yōu)勢細菌和放線菌的鑒定①形態(tài)特征及培養(yǎng)特征的測定：經(jīng)純化的優(yōu)勢細菌與放線菌分別劃線接種于牛肉膏蛋白胨和3種放線菌鑒定培養(yǎng)基上，恒溫箱中培養(yǎng)2～5 d后觀察并描述菌落的形態(tài)、大小、光澤、質(zhì)地、邊緣特征、表面特征、隆起形狀、透明度、菌落及培養(yǎng)基的顏色等特征;②生理生化特性的測定：采用周德慶［5］的方法進行生理生化特性分析;③16S rRNA基因序列分析：優(yōu)勢細菌與放線菌的DNA提取采用反復(fù)凍融法，以此為模板進行PCR擴增。引物序列：P1：5'-CCG GAT CCAGAG TTT GAT CAT GGC TCAGCA-3'，P2：5'-CGG GAT CCTACG GCTACC TTG TTACGACTT-3'。本實驗的PCR引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(總體積29 μL)：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)2 μL，引物1(27f)2.5 μL，引物2(1492r)2.5 μL，TaKaRa Ex Taq(5 U/μL)0.5 μL，模板DNA 3 μL，無菌去離子水16 μL。PCR擴增條件：94℃5 min;94℃30 s，57℃30 s，72℃1.5 min;30個循環(huán);72℃5 min。PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。將所測得的16S rRNA序列用BLAST搜索工具從Gen-Bank中調(diào)出與其相關(guān)的16S rRNA序列，然后用CLASTAL X軟件進行多序列比對，并采用MEGA4.1軟件中的鄰位相接法(N-J法)進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建與同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同巢材中優(yōu)勢菌群的分離結(jié)果

不同巢材樣品的稀釋液，采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行培養(yǎng)后，根據(jù)細菌菌落的形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)性狀對細菌進行初步歸類，經(jīng)過多次的分離純化共從10份巢材中分離出6種優(yōu)勢細菌，其中苔蘚巢材與草葉巢材中優(yōu)勢細菌各3株，依次為TX3、TX4、TX12、CX3、CX13、CX20。利用高氏一號培養(yǎng)基共從巢材中分離出8種放線菌，其中草葉巢材3種，苔蘚巢材中5種。將分離出的優(yōu)勢細菌和放線菌進一步純化，進行保存和下一步的鑒定實驗。

2.2 菌體的個體形態(tài)觀察及生理生化鑒定結(jié)果

2.2.1 優(yōu)勢細菌菌體的個體形態(tài)觀察及生理生化鑒定結(jié)果分離出6株優(yōu)勢菌株中，除TX3菌落為蠟樣不透明、表面粗糙外，TX4、TX12、CX3、CX13和CX20菌落均光滑發(fā)亮，表面呈粘稠狀，其中TX4與CX20為土黃色，CX3與CX13為乳白色，TX12為蟹黃色，所有菌體都呈桿狀。其生理生化特性實驗結(jié)果見表1。

表1 不同巢材所獲優(yōu)勢細菌的生理生化特性試驗結(jié)果Table 1 The physiological characteristics of dominant bacterial colonies obtained from different nest materials

所有菌株硝酸鹽還原和觸酶反應(yīng)均為陽性，均能產(chǎn)酸。其中只有TX3菌株的乳糖反應(yīng)與氧化酶反應(yīng)為陰性，TX3、TX12、CX13和CX20的MR反應(yīng)與VP反應(yīng)均為陰性，TX3、TX4、CX13和CX20均能產(chǎn)生吲哚，TX4、CX13和CX20革蘭染色呈陰性，其余3株呈陽性。

2.2.2 放線菌的個體形態(tài)觀察及鑒定結(jié)果經(jīng)過多次的分離純化共得到放線菌TF1、TF2、TF3、TF4、TF6、CF2、CF3、CF4 8株，其培養(yǎng)特征實驗結(jié)果見表2。

表2 不同巢材所獲放線菌在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征Table 2 Cultivating characteristics of actinomycetes obtained from different nest materials in different media

除TF1外，其余7株放線菌均有氣生菌絲和孢子絲特征性結(jié)構(gòu)，孢子絲或螺旋或波曲，均呈彎曲狀，根據(jù)形態(tài)特征初步將其定為鏈霉菌屬。在淀粉瓊脂培養(yǎng)基上，除TF1產(chǎn)生檸檬黃色色素，其他7株放線菌均不產(chǎn)生色素。根據(jù)鏈霉菌鑒定手冊，TF1孢子絲灰色，基絲淺黃，應(yīng)歸為金色類群;TF2孢子絲淡紫灰色，基絲乳黃色，將其歸為淡紫灰類群;TF3孢子絲灰色，基絲無色，歸為燼灰類群;TF4孢子絲灰色，基絲深褐色，歸為灰褐類群;TF6孢子絲白色，基絲乳脂色，歸為白孢類群;CF2孢子絲灰色，基絲無色，歸為燼灰類群;CF3孢子絲白色，基絲淺褐色，歸為白孢類群;CF4孢子絲淺灰色，基絲栗棕色，歸為灰褐類群。

2.3 菌體的16S rRNA基因序列分析

2.3.1 優(yōu)勢細菌16S rRNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位的確定將所測得的6個細菌菌株的基因序列與GenBank中已有的16S rRNA序列進行BLAST比對，選取同源性高的菌株并結(jié)合伯杰氏細菌鑒定手冊描述的生理生化特性對所測菌株進行鑒定。

TX3菌株為芽胞桿菌屬，與蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)親緣關(guān)系最近，序列相似性為100%，結(jié)合生理生化反應(yīng)可鑒定為TX3菌株為蘇云金芽胞桿菌。TX4菌株為腸桿菌屬，與陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)親緣關(guān)系近，序列相似性為99%。TX12菌株為棒狀桿菌屬，與馬氏棒桿菌(Corynebacterium matruchotii)親緣關(guān)系最近，序列相似性為99%。CX3菌株為腸桿菌屬，與霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei)親緣關(guān)系最近，序列相似性為99%。CX20菌株為假單胞菌屬，與麝香石竹假單胞菌(Pseudomonas caryophylli)親緣關(guān)系最近，序列相似性為99%。CX13菌株為假單胞菌屬，與丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)親緣關(guān)系最近，序列相似性為99%。結(jié)合6株細菌的菌體特征和生理生化鑒定結(jié)果確定了苔蘚巢材中的3株細菌分別屬于芽胞桿菌屬、腸桿菌屬和棒狀桿菌屬，草葉巢材中的3株細菌屬于腸桿菌屬和假單胞菌屬。

2.3.2 放線菌16S rRNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位的確定提取放線菌基因組DNA，進行PCR反應(yīng)，將結(jié)果送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測定的8個菌株的16S rRNA基因在1 435～1 475個堿基之間。經(jīng)測序結(jié)果BLAST分析，8株放線菌都屬鏈霉菌屬，根據(jù)《鏈霉菌鑒定手冊》中鏈霉菌屬內(nèi)12類群區(qū)分方法將8株放線菌分別劃分類群。在各菌株所屬類群中選取生理指標相似菌種的標準菌株序列構(gòu)建NJ進化樹，實驗結(jié)果見圖1。

圖1 根據(jù)8株放線菌菌株16S rRNA基因序列構(gòu)建的NJ進化樹Fig.1 NJ phylogenetic tree constructed by 16S rRNA gene sequences of 8 strains’actinomycetes strains

結(jié)合8株放線菌菌株16S rRNA構(gòu)建的NJ進化樹及其培養(yǎng)特征以及生理生化特征可確定，不同巢材中分離出來的8株放線菌均為鏈霉菌屬。TF1菌株與金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)親緣關(guān)系最近，序列相似性為99%，結(jié)合生理生化及培養(yǎng)特征確定TF1菌株為金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)。TF2菌株與紅色淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces rubrolavendulae)序列相似性為100%，結(jié)合培養(yǎng)特征可以確定二者為同一種菌，屬淡紫灰類群。TF3菌株與銀樣鏈霉菌(Streptomyces argenteolus)序列相似性為99%，其培養(yǎng)特征與Streptomyces argenteolus相似，但Streptomyces argenteolus不利用蔗糖，棉子糖，因此還需對TF3進行進一步的分類鑒定。TF4菌株與魯特格斯鏈霉菌(Streptomyces rutgersensis)序列相似性為98%，根據(jù)鏈霉菌鑒定手冊將其歸為灰褐類群，Streptomyces rutgersensis在馬鈴薯塊上產(chǎn)生淺褐色素，TF4在馬鈴薯塊上無色素，因此二者是否為同一種菌，還需進一步鑒定。TF6菌株與膠樣鏈霉菌(Streptomyces gelaticus)序列相似性為99%，根據(jù)鏈霉菌鑒定手冊將其歸為白孢類群，與Streptomyces gelaticus的特征基本相似，Streptomyces gelaticus在馬鈴薯塊上基絲微綠變黑，有帶微黃邊緣的色素，因此二者有可能是同一種菌。CF2菌株與灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)序列相似性為100%，結(jié)合生理生化特性基本可以確定二者為同一種菌，屬燼灰類群。CF3菌株與純白鏈霉菌(Streptomyces candidus)序列相似性為99%，根據(jù)培養(yǎng)特征依據(jù)鏈霉菌鑒定手冊將其歸為白孢類群，與Streptomyces candidus相比，其生理生化特征相似，但Streptomyces candidus在馬鈴薯塊上基絲無色，呈地衣狀，無色素或產(chǎn)生微褐色素，因此二者是否為同一種菌，還需進一步鑒定。CF4菌株與小孢鏈霉菌(Streptomyces microsporus)序列相似性為99%，根據(jù)鏈霉菌鑒定手冊將其歸為灰褐類群，但Streptomyces microsporus在葡萄糖天門冬素瓊脂上不產(chǎn)生色素，在馬鈴薯塊上基絲呈褐黃、薯塊栗色，與CF4有差別，因此二者是否為同一種菌還需要進一步的分類鑒定。

3 討論

苔蘚植物是一類以孢子繁殖，由水生向陸生過渡的高等植物，其分布廣泛，多數(shù)能夠合成具有抗微生物活性的次生代謝產(chǎn)物以保護自身，抵抗微生物的侵害。Pinheiro［6］研究報導(dǎo)了25種苔蘚植物不同溶劑對枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌3種細菌的抗菌活性。衣艷君［7］對黃牛毛蘚(Herba ditrichi)及毛尖紫萼蘚(Grimmiapilifera beauv)的水浸液進行了抑菌圈試驗，發(fā)現(xiàn)這兩種植物的水浸液對幾種細菌和真菌均有不同的抑制活性。Gang等［8］對9種苔蘚植物的水提液和醇提液的抑菌活性進行了檢測，結(jié)果表明這幾種苔蘚植物的醇提液對4種常見的細菌有較明顯的活性，而水提液的效果不明顯。Meenakshi等［9］分析15種印度苔蘚乙醇萃取物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)暖地泥炭蘚(Sphagnum junghuhnianum)、爪哇扭口蘚(Barbula javanica)等7種蘚類對8種真菌具有抗菌活性。本研究對苔蘚巢和草葉巢中的放線菌進行分離培養(yǎng)，從苔蘚巢材中分離出5種優(yōu)勢放線菌，從草葉巢材中分離出3種優(yōu)勢放線菌。從苔蘚巢材中分離出的放線菌中有一種優(yōu)勢放線菌為金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)，以往的研究表明金色鏈霉菌的次級代謝產(chǎn)物—金核霉素作為殺菌劑對多種細菌病害具有優(yōu)異效果并對人畜與環(huán)境具有良好安全性［10］。從苔蘚巢材中分離出另外4種放線菌也均為鏈霉菌，其中灰色鏈霉菌同時存在于草葉巢中。苔蘚中鏈霉菌無論在數(shù)量和種類上都多于草葉中的鏈霉菌(表2)，而鏈霉菌的生防作用一直被人們所研究和利用［11］，這可能是一些鳥類在繁殖期選取苔蘚作為巢材的原因之一。

本研究在草葉巢材中分離的優(yōu)勢細菌中，3株都為革蘭陰性短桿菌(假單胞菌屬和腸桿菌屬)，在苔蘚中分離得到的3株優(yōu)勢菌中2株為革蘭陽性長桿菌(芽胞桿菌屬和棒狀桿菌屬)，1株為2種材料中共有的革蘭陰性菌(腸桿菌屬)。其中蘇云金芽胞桿菌已被作為生物殺蟲劑運用在農(nóng)業(yè)方面［12］，而CX13、CX20所屬的假單胞菌的致病性也越來越多地被研究者發(fā)現(xiàn)［13-14］。苔蘚中放線菌數(shù)量多于草葉中放線菌也從另一個角度解釋了苔蘚中細菌數(shù)少于草葉中細菌數(shù)的可能的原因，綜合以上研究結(jié)果可以看出，苔蘚與草葉相比是一種更安全的巢材，能夠為雛鳥提供更有利生長的生存環(huán)境，這或許也是一些鳥類選擇苔蘚作為巢材的原因之一。

［1］ Jones M P.Selected Infectious Diseases of Birds of Prey［J］.Journal of Exotic Pet Medicine，2006，15(1)：5-17.

［2］ 周艷，蘇慧，郭曉燕，等.北京小龍門自然保護區(qū)四種苔蘚鳥巢的觀察［J］.動物學(xué)雜志，2005，40(5)：110-113.

［3］ 杜楊，霍雅鵬，萬冬梅，等.雜色山雀對人工巢箱內(nèi)苔蘚類巢材的選擇［J］.動物學(xué)雜志，2010，45(4)：144-149.

［4］ 許光輝，鄭洪元.土壤微生物分析方法手冊［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1986：87.

［5］ 周德慶.微生物學(xué)實驗手冊［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986.

［6］ Pinheiro MDFDS，Lisboa RCL，Brazao RDV.Contribution to the study of bryophytes as sources of antibiotie［J］.Streptomyces Acta Amazonica，1989，19(1)：139-146.

［7］ 衣艷君.苔蘚植物的抑菌性研究［J］.淄博學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)與工程版)，2001，3(3)：78-80.

［8］ Gang YY，DU GS，Wang MZ，Meng FY.Studies on antibacterial activities of 9 Chinese bryophyte［J］.Streptomyces Chenia，2005，(8)：71-76.

［9］ Meenakshi S，Rawat A K S，Govindarajan R.Antimicrobial activity of some Indian mosses［J］.Fitoterapia，2007，38(2)：156-158.

［10］ 陶黎明，徐文平.新穎微生物源殺菌劑—金核霉素［J］.世界農(nóng)藥，2005，27(3)：45-46.

［11］ 朱宏建，易圖永，周鑫鈺.土壤放線菌生防活性物質(zhì)的研究進展［J］.作物研究，2007，21(2)：149-151.

［12］ 周燚.微生物農(nóng)藥研發(fā)與應(yīng)用-農(nóng)業(yè)生物技術(shù)系列［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

［13］ 毛德強，盧仙娥.銅綠假單胞菌致病、耐藥機理研究進展.國外醫(yī)學(xué)［J］.臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊，2001，22(3)：142-143.

［14］ 徐懷英，朱瑞良.銅綠假單胞菌致病作用及防治［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2000，(11)：16-17.