縫隙連接在同型半胱氨酸介導(dǎo)的高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用

王恩幫，鐘華，羅小林，梁霄，鄧峰美，司軍強(qiáng)，何芳

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002）

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）增殖、遷移和表型的變化導(dǎo)致的血管壁增厚和血管緊張度的增加是高血壓發(fā)病的關(guān)鍵。由縫隙連接蛋白（connexin，Cx）構(gòu)成的直接通訊－縫隙連接（gap junction，GJ）在調(diào)節(jié)血管舒縮、血管平滑肌細(xì)胞增殖、平滑肌的表型轉(zhuǎn)變中起著重要作用，并與高血壓發(fā)生密切相關(guān)［1］。我們及其他學(xué)者前期的研究發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血漿水平升高使HUVEC中內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性減弱、一氧化氮（nitric oxide，NO）含量降低，并削弱了 NO的血管舒張作用，增加氧化應(yīng)激，刺激血管平滑機(jī)細(xì)胞增生，改變血管壁彈性，增加血管阻力，因此促成血壓升高［2－3］，GJ是否參與了 Hcy介導(dǎo)的高血壓大鼠VSMCs增殖效應(yīng)尚不清楚。因此，本文以體外培養(yǎng)自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs為研究對象，初步探討了縫隙連接在Hcy介導(dǎo)的高血壓大鼠VSMCs增殖中的作用。

1 材料與方法

1．1 取材、細(xì)胞培養(yǎng)及VSMCs的鑒定

依據(jù)本研究室以前的方法培養(yǎng)VSMCs［4］，并對其細(xì)胞形態(tài)學(xué)及α－平滑肌肌動蛋白（α－action）抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，取3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1．2 MTT法檢測不同濃度Hcy對自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs增殖的影響

制備細(xì)胞懸液。用含10%FBS的DMEM液稀釋成5×104個cell／mL，接種于96孔板，每孔加入200μL混勻后的細(xì)胞懸液，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h。棄去培養(yǎng)液，用PBS液沖洗1～2遍。每孔加入不含F(xiàn)BS的DMEM液，各200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步于G0／G1期。棄去培養(yǎng)液，分別按以下分組加入試劑：分為5組，每組10個復(fù)孔，（1）：對照組，加200μL含2%FBS的DMEM液；（2）：不同濃度Hcy處理組，分別加入含Hcy濃度為 0．025mmol／L、0．05mmol／L、0．1 mmol／L、0．2mmol／L、0．5mmol／L 及2%FBS的DMEM液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，各組棄去培養(yǎng)液，每孔加入 MTT20μL，孵育4h，加入DMSO150 μL，于酶標(biāo)儀上檢測各孔570nm處吸光度（A值）。

1．3 MTT法檢測縫隙連接在Hcy介導(dǎo)的自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs增殖中的作用

制備細(xì)胞懸液。用含10%FBS的DMEM液稀釋成5×104個cell／mL，接種于96孔板，每孔加入200μL混勻后的細(xì)胞懸液，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h。棄去培養(yǎng)液，用PBS液沖洗1～2遍。每孔加入不含F(xiàn)BS的DMEM液，各200μL，繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步于G0／G1期。棄去培養(yǎng)液，分別按以下分組加入試劑。分4組，每組10個復(fù)孔，分別如下：（1）：對照組，自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs，加200μL含2%FBS的DMEM液；（2）：Hcy處理組，自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs加入含Hcy濃度為0．05mmol／L及2%FBS的DMEM液；（3）：縫隙連接阻斷劑組（18α－GA），自發(fā)性高血壓大鼠 VSMCs加入18α－GA使其終濃度為50 μmol／L，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；（4）：縫隙連接阻斷劑＋Hcy組（Hcy＋18α－GA），自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs加入含 Hcy濃度為0．05mmol／L及2%FBS的DMEM 液，使得18α－GA終濃度50μmol／L。各組棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT20μL，孵育4 h，加入DMSO150μL，于酶標(biāo)儀上檢測各孔570nm處吸光度（A值）。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以ˉX±S示，應(yīng)用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 不同濃度Hcy對自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs增值的影響（表1）

用不同濃度的Hcy刺激正常大鼠血管平滑肌細(xì)胞24h，結(jié)果見表1和圖1。

表1 不同濃度Hcy對自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增值作用±S，n＝10 Tab．1The effects of different concentrations Hcy on the VSMCs proliferation in the spontaneouslyhypertensive rats

表1 不同濃度Hcy對自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增值作用±S，n＝10 Tab．1The effects of different concentrations Hcy on the VSMCs proliferation in the spontaneouslyhypertensive rats

注：＊P＜0．05，與對照組比較。

組別 A570 0．37±0．04 Hcy（0．025mmol／L） 0．44±0．06＊Hcy（0．05mmol／L） 0．44±0．02＊Hcy（0．1mmol／L） 0．43±0．03 Hcy（0．2mmol／L） 0．41±0．05 Hcy（0．5mmol／L）對照組0．40±0．04

表1和圖1顯示：當(dāng)Hcy濃度為0．1mmol／L、0．2mmol／L、0．5mmol／L時，所測的 A 值與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；Hcy濃度為0．025mmol／L、0．05mmol／L時測得 A 值顯著高于對照組（P＜0．05）；Hcy濃度0．05mmol／L 組與0．025mmol／L組相比，A值無顯著差異（P＞0．05）。

圖1 不同濃度Hcy刺激對自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖作用Fig．1The effects of different concentrations Hcy on the VSMCs proliferation in the spontaneously hypertensive rats

2．2 縫隙連接在Hcy介導(dǎo)的自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs增殖中的作用

經(jīng)過不同處理因素作用24h后，結(jié)果（表2，圖2）顯示：與對照組相比，Hcy組A值顯著升高，縫隙連接阻斷劑（18α－GA）組顯著降低（P＜0．05），Hcy＋18α－GA組與對照組相比無顯著差異（P＞0．05）；18α－GA組A值明顯低于 Hcy組（P＜0．05），Hcy＋18α－GA組測得A值明顯低于Hcy組，高于18α－GA組（P＜0．05）。

表2 縫隙連接在Hcy介導(dǎo)的自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs增殖中的作用±S，n＝10 Tab．2The roles of gap junctions in Hcy mediated VSMCs proliferation in the spontaneously hypertensive rats

表2 縫隙連接在Hcy介導(dǎo)的自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs增殖中的作用±S，n＝10 Tab．2The roles of gap junctions in Hcy mediated VSMCs proliferation in the spontaneously hypertensive rats

注：﹡P＜0．05，與對照組比較；△P＜0．05，與 Hcy組比較；＃P＜0．05，與18α－GA組比較。

組別 A570 0．37±0．04 Hcy（0．05mmol／L） 0．44±0．02＊18α－GA（50μmol／L） 0．27±0．02＊Hcy＋18α－GA 0．30±0．05＃△對照組

圖2 縫隙連接在Hcy介導(dǎo)的自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs增殖中的作用Fig．2The roles of gap junctions in Hcy mediated VSMCs proliferation in the spontaneously hypertensive rats

3 討論

近來的研究表明高同型半胱氨酸血癥能夠?qū)е卵軆?nèi)皮損害，促進(jìn)低密度脂蛋白的氧化、血小板的聚集、血管平滑肌細(xì)胞增殖，對正常大鼠VSMCs的作用由于細(xì)胞密度，Hcy濃度的不同而不同。研究發(fā)現(xiàn)一定劑量的Hcy能誘導(dǎo)自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs的增殖［5－6］，本文通過 MTT法檢測 Hcy對體外培養(yǎng)的自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)：Hcy濃度在0．025，0．05mmol／L時血管平滑肌細(xì)胞增殖增加明顯，當(dāng)Hcy濃度＞0．1mmol／L時，隨著濃度的升高，細(xì)胞增殖增加明顯開始降低，但與對照組相比細(xì)胞仍呈現(xiàn)增殖趨勢。

縫隙連接（gap junction，GJ），又稱間隙連接、通訊連接，是由連接相鄰兩個細(xì)胞之間的連接通道排列而成的一種特殊膜結(jié)構(gòu)。細(xì)胞間的通訊方式可分為間接與直接方式。相鄰細(xì)胞間通過縫隙連接所介導(dǎo)的細(xì)胞間的通訊為直接通訊，又稱縫隙連接細(xì)胞間 通 訊 （gap junction inter－cellular communication，GJIC）。相鄰細(xì)胞通過直接通訊進(jìn)行信息、能量和物質(zhì)交換，參與細(xì)胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)和電信號傳遞的電偶聯(lián)，對細(xì)胞的新陳代謝 內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和血管平滑肌舒縮等生理過程起著重要的調(diào)控作用。為了今后進(jìn)一步研究Hcy血漿水平升高是否通過改變Cx的表達(dá)調(diào)節(jié)GJ的功能，影響細(xì)胞間直接通訊，并導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖，我們首先通過MTT法及縫隙連接阻斷劑初步研究了縫隙連接在Hcy介導(dǎo)的自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用。取生長自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs分4組加入不同的試劑：對照組，Hcy組，18α－GA組和 Hcy＋18α－GA組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比；Hcy組A值明顯高于對照組，提示Hcy促進(jìn)了自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs的增殖；18α－GA組低于對照組（P＜0．05）提示縫隙連接參與了自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs的增殖；Hcy＋18α－GA組A值明顯低于 Hcy組而高于18α－GA組（P＜0．05），但與對照組相比無顯著差異（P＞0．05）說明當(dāng)縫隙連接阻斷后，完全阻斷了Hcy促進(jìn)自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs增殖的效應(yīng)；提示縫隙連接可能參與了Hcy介導(dǎo)的自發(fā)性高血壓血管平滑肌細(xì)胞增殖作用。

總之，我們的研究初步證實(shí)，縫隙連接可能參與了Hcy介導(dǎo)的高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖，但在各處理因素作用下自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞縫隙連接的蛋白表達(dá)又有何變化，縫隙連接功能有何變化，還有待進(jìn)一步研究。該研究結(jié)果對進(jìn)一步闡明Hcy在高血壓等血管平滑肌細(xì)胞增殖相關(guān)疾病中的作用機(jī)制提供了重要理論依據(jù)，可為心腦血管疾病防治提供新靶標(biāo)。

［1］Azzam E I，Toledo S M，Little J B，et al．Evidence for the participation of gap junction mediated intercellular communication in the transmission of damage singals from irradiated to nonirradiated cells［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（2）：247－248．

［2］張會敏，張海洋，鄧峰美，等．同型半胱氨酸對鈣離子激活狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性及NO含量的影響［J］．石河子大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，25（2）：196－199．

［3］Rodrigo R，Passalacqua W，Araya J，et al．Homocysteine and essential hypertension［J］．J Clin Pharmacol，2003，43（12）：1299－1306．

［4］鐘華，黃剛，趙丹，等．ERK 通路對 TGF－β＿1介導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用［J］．石河子大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，26（1）：1－5．

［5］Lee H Y，Chae I H，Kim H S．Differential effects of homocysteine on porcine endothelial and vascular smooth muscle cells［J］．J Cardio vasc Pharmacol，2002，39（5）：643－651．

［6］Woo D K，Dudrick S J，Sumpio B E．Homocysteine stimulates MAP kinase in bovine aortic smooth muscle cells［J］．Surgery，2000，128（1）：59－66．