出芽短梗霉胞外酸性漆酶

王慧娟，孔維甲，靳建忠，張寧，李炳學(xué)*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽110866;2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽110866)

漆酶(氧化還原酶類EC 1.10.3.2，laccase)是一種含銅的多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)，和植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動(dòng)物的血漿銅藍(lán)蛋白同屬銅藍(lán)氧化酶(blue copperoxidases)家族［1］。在自然界中，漆酶分布于多種植物、真菌體內(nèi)、以及少數(shù)昆蟲和細(xì)菌中［2］。分泌漆酶的真菌主要存在于半知菌綱(Deuteromycetes)、子囊菌綱(Ascomycetes)和擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)等高等真菌［3］。其中，擔(dān)子菌亞門的白腐真菌是主要的木質(zhì)素降解酶的分泌者［4］，因而也成為漆酶研究的首選菌種資源。木質(zhì)素氧化酶中錳依賴過氧化物酶(Manganese oxidizing peroxidase，MnP)需要H2O2和Mn2+的存在。另一類過氧化物酶不需要Mn2+，但是H2O2是必要的，被稱為不依賴錳過氧化物酶(Manganese independent peroxidase，MiP)。因?yàn)镠2O2對(duì)于MnP和MiP的酶活性是必需的，漆酶(Laccase，Lac)反應(yīng)不需要H2O2，所以添加過氧化氫酶可以去除反應(yīng)體系中H2O2污染，測定粗酶液中漆酶的活性。漆酶反應(yīng)只需要分子氧和底物，而且漆酶的底物非常廣泛，因此漆酶的應(yīng)用潛力大于其他類型的木質(zhì)素降解酶。由于漆酶可以分解木質(zhì)素、將色素脫色、氧化苯酚及其衍生物、降解有機(jī)氯農(nóng)藥DDT(二氯二苯三氯乙烷)等土壤污染物，所以漆酶是環(huán)保領(lǐng)域的常用酶制劑，主要應(yīng)用在造紙廠的污水處理和紙漿生物漂白［5］、染料脫色［6］、有毒化合物的生物降解和土壤修復(fù)以及有機(jī)合成［7］等方面。羊毛染色常用的染料在酸性環(huán)境下才能著色［8］，此類染料廢液酸性很強(qiáng)。處理這類特殊工業(yè)染料，就需要酸性漆酶。普通漆酶最適pH接近中性，在酸性環(huán)境(pH低于3.0)活性弱而且穩(wěn)定性低，無法使用。通過酶的化學(xué)修飾和基因突變等手段，很難將已有中性漆酶變成耐酸性漆酶，所以尋找新的酸性漆酶資源具有重要現(xiàn)實(shí)意義。出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)屬于半知菌短梗霉屬，是一類具有酵母型和菌絲型等多種形態(tài)并且能夠合成黑色素的真菌，目前國內(nèi)外均沒有關(guān)于其是否合成和分泌多酚氧化酶的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種A.pullulans NG和A.pullulans CA是本實(shí)驗(yàn)保存菌株;CBS 147.97、CBS 584.75、CBS 100225、CBS 110373、CBS 101160、CBS 249.65、CBS 701.76和CBS 110374來自于荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)。

1.1.2 培養(yǎng)基菌株保藏培養(yǎng)基(YAD):葡萄糖2%，(NH4)2SO40.5%，MgSO4·7H2O 0.05%，Yeast extract 0.02%，KH2PO40.1%，瓊脂2%，pH 6.0;基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(YND):葡萄糖2%，NaNO30.64%，MgSO4·7H2O 0.05%，Yeast extract 0.02%，KH2PO40.1%，pH 6.0。

1.1.3 主要試劑過氧化氫酶(Sigma)、乙二胺四乙酸(EDTA)、過氧化氫(H2O2:30%)和愈創(chuàng)木酚(2-甲氧基苯酚)等試劑均為分析純。

1.1.4 儀器SP-722E型可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)，SHA-C水浴恒溫振蕩器(國華)，PHS-25型數(shù)字pH計(jì)(上海理達(dá)儀器廠)，SCR20BC型低溫高速離心機(jī)(日立)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件按體積比1∶100的接種量接種經(jīng)180 r/min水浴搖床28℃活化18 h的種子液(OD560=3.0)到含有50 mL YND培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃180 r/min震蕩培養(yǎng)。將培養(yǎng)一定時(shí)間的培養(yǎng)液于4℃，6 000 r/min離心10 min，棄去沉淀得到的上清液即為粗酶液。

1.2.2 多酚氧化酶活性分析①測定酶反應(yīng)最適pH:在含有2.5 mmol/L愈創(chuàng)木酚的不同pH梯度的緩沖液(pH 1.0～2.0，氯化鉀-鹽酸緩沖液;pH 2.4～4.0，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液)中，加入500 μL粗酶液，總體積為4 mL。30℃反應(yīng)5 min后用紫外可見分光光度計(jì)測定470 nm吸光值(A470)，每處理3重復(fù)取平均值。繪制酶反應(yīng)最適pH曲線，確定各菌株胞外多酚氧化酶最適pH值;②多酚氧化酶活性測定:在pH 2.0氯化鉀-鹽酸緩沖液中，按照①方法測定出芽短梗霉胞外多酚氧化酶活性。每分鐘產(chǎn)生1 nmol顯色產(chǎn)物所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位。酶活性計(jì)算:A470=?bC(?470=1.21×104L/(mol·cm);b:1 cm;C:mol/L)，酶活U=1.6×106·C=132.23×A470。

1.2.3 確定多酚氧化酶種類［9］在上述多酚氧化酶活性分析體系中，通過添加H2O2(0.05 mmol/L)和Mn2+(20 mmol/L)檢測總的木質(zhì)素氧化酶活性(處理A)。含有H2O2，不添加Mn2+，并且添加EDTA(20 mmol/L)除去反應(yīng)體系中可能存在的Mn2+，抑制錳過氧化物酶(MnP)，測定的酶活包括MiP和Lac(處理B)。不添加Mn2+，不添加H2O2，并且添加過氧化氫酶(200 U/L)除去反應(yīng)體系中可能存在的H2O2，抑制MnP和MiP，測定的就是Lac活性(處理C)。在處理C中再添加EDTA(20 mmol/L)為處理D，檢測EDTA對(duì)Lac活性的影響?；钚詼y定方法同1.2.2，緩沖液pH 2.0，30℃反應(yīng)5 min測定A470，每處理3重復(fù)。

1.2.4 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹以NCBI的GenBank上檢索的各菌株的ITS1 rDNA序列，運(yùn)用MEGA3［10］軟件構(gòu)建各菌株neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 出芽短梗霉胞外多酚氧化酶活性分析

通過愈創(chuàng)木酚平板篩選，在候選的10株菌中發(fā)現(xiàn)5株菌株分泌胞外多酚氧化酶。該5株菌的搖瓶發(fā)酵液胞外多酚氧化酶活性差異很大。NG粗酶液酶活最高，達(dá)到110 U/mL。酶活相對(duì)較高的是菌株CBS 147.97(48 U/mL)和CA(40 U/mL)，產(chǎn)酶能力較弱的是CBS 584.75(18 U/mL)和CBS 101160(11 U/mL)(圖1A)。生長繁殖過程中，不同菌株分泌多酚氧化酶的最佳培養(yǎng)時(shí)間也顯著不同。產(chǎn)酶最多的NG最佳培養(yǎng)時(shí)間為8 d左右，而CBS 584.74僅需3 d即可獲得胞外最大酶活。

2.2 胞外多酚氧化酶最適pH分析

對(duì)分泌多酚氧化酶的5株菌粗酶進(jìn)行最適pH測定，NG等4菌株的最適pH為2.0，CBS 584.75最適pH在2.0左右，范圍很寬(1.6～2.4)(圖1B)。由于出芽短梗霉生長后期胞外環(huán)境pH多為酸性，推測該類酸性多酚氧化酶對(duì)菌體細(xì)胞可能具有特定的生理功能或生態(tài)學(xué)意義。

圖15 菌株胞外粗酶活性分析Fig.1 Enzyme activity of 5 strains crude enzyme

2.3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹與胞外多酚氧化酶關(guān)系

分泌多酚氧化酶的5株菌分布在3個(gè)群中，其中NG、CBS 101160和CBS 584.75同屬一個(gè)群(圖2)。該群的其他3菌株，CBS 110373、CBS 110374和CBS 701.76無多酚氧化酶分泌。推測，在進(jìn)化過程中基因突變導(dǎo)致同一群的不同菌株之間胞外多酚氧化酶的性狀變異較大。

2.4 NG菌株多酚氧化酶種類分析

5株分泌多酚氧化酶的出芽短梗霉中NG粗酶液酶活最高，并且在pH 1.2～2.4之間均保持良好的活性(圖1B)。為確定NG胞外粗酶性質(zhì)，進(jìn)行了多酚氧化酶種類驗(yàn)證試驗(yàn)。處理A為MnP、MiP和Lac均可以反應(yīng)的陽性對(duì)照，酶活為(87.6±1.8)U/mL。處理B測定的酶活包括MiP和Lac，該處理的酶活為(74.0±2.2)U/mL，比處理A總酶活有所降低，但差異不顯著。處理C添加過氧化氫酶除去反應(yīng)體系中可能存在的H2O2，同時(shí)抑制MnP和MiP，體現(xiàn)的是Lac活性((71.7±0.7)U/mL)，推測出芽短梗霉中NG分泌的多酚氧化酶就是漆酶。處理D酶活性是處理C的98.5%，表明該類漆酶不被高濃度EDTA(20 mmol/L)顯著抑制(表1)。由于二價(jià)銅離子能夠被EDTA螯合，因此推測出芽短梗霉NG分泌的漆酶不需要銅離子作為輔基。不依賴金屬離子作為輔基的漆酶，不需要額外添加輔基穩(wěn)定活性，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)更方便，成本也更低。

表1 NG酸性多酚氧化酶屬于漆酶的證明Table 1 analysis of the NG acid polyphenol oxidase

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn):出芽短梗霉是分離多酚氧化酶的優(yōu)良真菌資源，本研究發(fā)現(xiàn)供試10株菌中有5株菌具有胞外多酚氧化酶活性;分泌多酚氧化酶的5株菌分布在3個(gè)群中，其中NG、CBS 101160和CBS 584.75屬同一個(gè)群;多酚氧化酶最適pH 2.0左右;菌株NG產(chǎn)生的多酚氧化酶活性最強(qiáng)，經(jīng)驗(yàn)證是漆酶，該酶不被EDTA抑制。

多數(shù)偏酸性漆酶以愈創(chuàng)木酚為底物反應(yīng)的最適pH多為4.0以上［3］，因此，A.pullulans NG分泌的漆酶是目前發(fā)現(xiàn)的最適pH較低的漆酶之一，在酸性漆酶資源開發(fā)領(lǐng)域具有巨大潛力。該酸性漆酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)分析的工作正在進(jìn)行中?？寺.pullulans NG漆酶合成和表達(dá)調(diào)控的基因，將從基因水平分析該漆酶的合成和分泌規(guī)律，是今后研究的重點(diǎn)之一。

圖2 基于ITS1 rDNA序列構(gòu)建MEGA3 neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining tree constructed with the MEGA3 package on the basis of ITS1 sequences

致謝:CBS 147.97等8株A.pullulans受贈(zèng)于荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)G.S.De Hoog教授，特此衷心感謝。

［1］ Rodgers CJ，Blanford CF，Giddens SR，et al.Designer laccases:a vogue for high-potential fungal enzymes［J］.Trends Biotechnol，2010，28:63-72.

［2］ Claus H.Laccases and their occurrence in prokaryotes［J］.Arch Microbiol，2003，179:145-150.

［3］ Baldrian P.Fungal laccases-occurrence and properties［J］.FEMS Microbiol Rev，2006，30:215-242.

［4］ Raghukumar C，D＇Souza-Ticlo D，Verma AK.Treatment of colored effluents with lignin-degrading enzymes:an emerging role of marine-derived fungi［J］.Crit Rev Microbiol，2008，34:189-206.

［5］ Majeau JA，Brar SK，Tyagi RD.Laccases for removal of recalcitrant and emerging pollutants［J］.Bioresour.Technol.，2010，101:2331-2350.

［6］ 姜慶宏，崔岱宗，趙敏，等.一株產(chǎn)漆酶真菌新月彎孢霉JQH-100在染料脫色中的應(yīng)用［J］.菌物學(xué)報(bào)，2010，29(5):678-682.

［7］ Adinarayana K，Susana C，Carlos G，et al.Engineering and applications of fungal laccases for organic synthesis［D］.Microbial Cell Factories，2008，7:32.

［8］ Ryan S，Schnitzhofer W，Tzanov T，et al.An acid-stable laccase from Sclerotium rolfsii with potential for wool dye decolourization［J］.Enzyme Microb.Technol.，2003，33:766-774.

［9］ Justin J.Isolation and characterization of a novel thermostable and catalytically efficient laccase from Peniophora sp.strain UD4［D］.Rhodes University，2005.

［10］ Kumar S T.MEGA3:Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment［J］.Briefings in Bioinformatics，2004，5:150-163.