52種熱帶藥用植物抗煙草青枯菌的體外活性篩選

姜雯婷，戴好富，劉壽柏，梅文莉*

(1.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院，海南?？?71737;2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點開放實驗室，海南?？?71101;3.?？谑袩釒烊划a(chǎn)物研究與利用重點實驗室，海南?？?71101)

煙草青枯病是由茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)引起的煙草一大毀滅性病害。該病廣泛分布于全世界的熱帶、亞熱帶和一些溫暖的地區(qū)，在我國煙草產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，局部地區(qū)發(fā)病嚴重［1］。青枯菌寄主范圍廣泛，可侵染54個科的450余種植物［2］。煙草青枯病的防治長期依賴化學(xué)防治，病原易產(chǎn)生抗藥性，故防效不明顯，化學(xué)藥劑的毒性強，對環(huán)境危害嚴重，且影響著煙葉的產(chǎn)量，是煙葉生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展中亟待解決的關(guān)鍵問題，所以尋找有效防治青枯病的技術(shù)與方法，是當今植物病理學(xué)研究的重要課題之一［3-4］。從植物中尋找對有害生物有抑制活性或殺傷作用的物質(zhì)是開發(fā)新農(nóng)藥的一個主要方法［5］。海南島藥用植物資源豐富，有維管束植物4 500多種，藥用植物3 100多種，其中特有的黎族藥近800種［6-7］，為尋找具有抗煙草青枯菌活性的熱帶藥用植物提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。本實驗運用濾紙片法和2倍稀釋法，對52種熱帶藥用植物的乙醇提取物進行煙草青枯菌的抑菌活性篩選，旨在尋找具有抗煙草青枯病活性的藥用植物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料共采集了52種熱帶藥用植物，分屬于31科47屬(表1)，主要采自海南?？?、儋州、昌江等地。植物樣品由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所代正福副研究員鑒定，憑證標本現(xiàn)存于熱帶生物技術(shù)研究所。

表1 供試熱帶藥用植物樣品Table 1 Samples of tropical medicinal plants tested

1.1.2 供試菌株煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)由云南大學(xué)生物資源保護與利用重點實驗室莫明和教授提供。

1.1.3 培養(yǎng)基［8］牛肉膏蛋白胨固體和液體培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基):牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 000 mL，調(diào)pH值至7.4～7.6，固體培養(yǎng)基:瓊脂20 g。

1.1.4 試劑甲醇、乙醇、氯化鈉均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠;牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉均為生物化學(xué)試劑，購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.5 儀器HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司;SW-40潔凈工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司;ZD-8802D搖床，太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司;Q/BKYY31-2000電恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠;HHB11360-S普通培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠;Delta 320-S pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 樣品和藥液的制備［9］樣品采集后自然晾干后，粉碎;用乙醇冷浸提取3次，分別浸提7、7、5 d，提取液合并在50℃下減壓濃縮至干，獲乙醇提取物。濃縮干燥后所得的浸膏用甲醇定容為質(zhì)量濃度100 mg/mL的溶液，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌懸液制備［10］將煙草青枯菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)將菌株轉(zhuǎn)移至裝有液體培養(yǎng)基三角瓶中，30℃恒溫搖床中培養(yǎng)24 h，振動頻率250 r/min。加入無菌生理水，稀釋成濃度為106個/mL的菌液。

1.2.3 抑菌試驗［11-12］采用濾紙片法進行測定。在營養(yǎng)瓊膠培養(yǎng)基平板上加入100 μL細菌懸浮液并涂布均勻。取樣品溶液10 μL，滴加到直徑6 mm的滅菌濾紙片上，風(fēng)干，制成含提取物干質(zhì)量劑量為1 mg的含藥濾紙片。然后用無菌鑷子夾取將含藥濾紙片倒置貼于細菌營養(yǎng)平板上，并輕輕按壓使充分接觸，每個平板5片，每處理重復(fù)3次。中間以相同劑量的甲醇溶液為對照。置30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后用十字交叉法測量抑菌圈直徑，求平均值。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定［13-14］對于抑菌效果明顯的提取物，采用2倍稀釋法，從質(zhì)量濃度100 mg/mL開始依次濃度減半，設(shè)置濃度梯度對煙草青枯菌進行作用，濃度梯度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.31、1.56 mg/mL，從而測定最低抑菌濃度(MIC)。在無菌條件下，按照前面的抑菌試驗方法進行，以剛好出現(xiàn)抑菌圈的濃度值作為最低抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈大小測定結(jié)果

本試驗一共測試了52種熱帶藥用植物對煙草青枯菌的抑菌作用，活性結(jié)果見表2。共有13種藥用植物顯示抑菌活性，抑菌圈大小依次為光葉巴豆＞酒餅簕＞簕欓花椒＞許樹=大管＞荔枝草＞光葉紫玉盤＞牛筋果=白欖樹＞細基丸＞鉤枝藤＞蜂巢草=長春花。其中光葉巴豆的活性最強，抑菌圈直徑為12 mm;抑菌圈直徑＞8 mm的熱帶藥用植物有6種，分別為酒餅簕、簕欓花椒、許樹、大管、荔枝草和光葉紫玉盤。這13種熱帶藥用植物分別屬于9科13屬，表現(xiàn)了抗菌植物的多樣性。

表2 13種熱帶藥用植物乙醇提取物對煙草青枯菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameter of inhibition zone of ethanol effects from 13 species of tropical medicinal plants against Ralstonia solanacearum

2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定結(jié)果

利用2倍稀釋法測定13種熱帶藥用植物抗煙草青枯病原菌的最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果見表3。酒餅簕的最小抑菌濃度為3.31 mg/mL，光葉巴豆和許樹的最小抑菌濃度均為6.25 mg/mL，表現(xiàn)為較強的活性。

表3 13種熱帶藥用植物乙醇提取物對煙草青枯菌的MICTable 3 The mensuration result of MIC of 13 species of tropical medicinal plants against Ralstonia solanacearum

3 討論

通過對52種熱帶藥用植物抗煙草青枯菌活性的初步篩選，結(jié)果表明，共有13種藥用植物顯示有抗煙草青枯菌的活性，其中光葉巴豆、酒餅簕和許樹的活性最強，其余呈現(xiàn)不同強度的抑菌活性。據(jù)鄭全喜等［15］報道，植物抑菌的主要成分是各種精油、酚類、生物堿和黃酮類等物質(zhì)。本實驗中測定的長春花、鉤枝藤中富含生物堿［16-17］，細基丸、光葉巴豆中含有黃酮［18-19］。因此，光葉巴豆、酒餅簕和許樹等13種藥用植物的活性大小可能與含有此類化合物有關(guān)，但不排除其他有效成分存在較強的抑菌作用可能性。同時，實驗表明抑菌圈大小與其相應(yīng)的MIC值不一定成平行關(guān)系，這可能是由于其提取物含有多種成分而各成分的活性強度各不相同所致［20］，因此，還需進一步跟蹤、研究提取物中各成分的抑菌活性大小及抑菌機理。實驗僅在室內(nèi)離體測定了植物樣品乙醇提取物的抑菌活性，提取物在活體上的表現(xiàn)如何，在田間試驗中能否表現(xiàn)防治作用，都還有待于進一步研究。本實驗對提取物的抗煙草青枯菌活性進行研究，為煙草青枯病的防治提供新的思路，

也為熱帶藥用植物資源的開發(fā)和利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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