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    TMPRSS4和onfFN在甲狀腺細針吸標本中的定量表達

    2011-01-10 02:01:21姚曉峰曹曉莉
    實用癌癥雜志 2011年2期
    關鍵詞:細針濾泡探針

    姚曉峰 張 侖 張 強 曹曉莉

    細針吸細胞學檢查(FNAB)是甲狀腺癌診斷和鑒別診斷的常用方法,它操作簡單、安全、快捷,并且具有較高的特異性和準確率。但是,F(xiàn)NAB也有一定的局限性和缺陷,由于細胞結構特點不明顯或取材不當而導致無法明確診斷,在臨床應用中受到一定的限制。本實驗應用熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR),檢測甲狀腺細針吸組織中TMPRSS4和onfFN mRNA的表達量,并探討其與FNAB聯(lián)合對甲狀腺癌診斷和鑒別診斷中的應用價值。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    收集天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院2006年1月至2007年7月。甲狀腺細針吸標本78例,其中術后病理檢查證實為甲狀腺癌45例,其中乳頭狀癌29例,濾泡癌9例,髓樣癌5例,未分化癌2例;男性18例,女性27例,年齡8~79歲,平均年齡48.5歲。甲狀腺良性病變33例,其中結節(jié)性甲狀腺腫16例,腺瘤13例,橋本氏甲狀腺炎4例;男性13例,女性20例,年齡16~72歲,平均年齡44歲。所有病例均行超聲引導下的細針吸細胞學檢查,其中一部分標本用于涂片后細胞學檢測,另一部分放入裝有TRIzol試劑試管內,然后在-80℃的冰箱內凍存。

    1.2 熒光定量RT-PCR

    TRIzol法提取甲狀腺細針吸標本的RNA,微量核酸檢測儀測定RNA濃度,瓊脂糖凝膠電泳判斷提取RNA的質量。引物與探針的設計采用Oligo 6.0軟件。TMPRSS4的引物和探針:Forward5′- CTG,CCT,TGG,GGT,GAC,AAT,CT-3′,Reverse5′- CAT,CGA,GGC,TGT,TCA,GAG,GTT-3′,Probe5′(FAM)- GGG,AGG,ATC,ACA,GAG,CCA,GCA,TGT,T-3′(TAMRA)。onfFN的引物和探針:Forward5′- GAG,GTG,CCA,CCT,ACA,ACA,TCA,TA -3′,Reverse5′- AGG,GGT,CAA,AGC,ACG,AGT,CAT-3′,Probe5′(FAM)- ACC,GTG,GGC,AAC,TCT,GTC,AAC,GAA,G -3′(TAMRA)。GAPDH的引物和探針:Forward5′- GAA,GGT,GAA,GGT,CGG,AGT,C -3′,Reverse5′- GAA,GAT,GGT,GAT,GGG,ATT,TC-3′,Probe5′(FAM)- CAA,GCT,TCC,CGT,TCT,CAG,CC -3′(TAMRA)。引物和探針均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。實驗步驟按照試劑盒(Invitrogen)說明書進行。熒光定量RT-PCR結果的計算:目的基因的標準值=2-(目的基因的Ct值-GAPDH的Ct值),Ct值表示PCR循環(huán)閾值。

    1.3 統(tǒng)計學方法

    所用數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0 for windows 統(tǒng)計軟件處理,良惡性腫瘤的比較采用t檢驗, TMPRSS4與onfFN的相關性采用線性相關檢驗。

    2 結果

    2.1 TMPRSS4、onfFN的表達情況

    RT-PCR結果顯示:甲狀腺癌和甲狀腺良性病變組織中TMPRSS4和onfFN mRNA的平均表達量分別為15.236±9.685、0.569±0.374和25.318±15.642、0.865±0.219,惡性與良性組織中兩者表達差異均有統(tǒng)計學意義(P均=0.000),2種分子標志物在甲狀腺癌組織中的表達呈正相關性(γ=0.374,P=0.026)。

    2.2 TMPRSS4和onfFN mRNA表達與甲狀腺癌臨床病理參數(shù)的關系

    由表1可見, TMPRSS4 mRNA和onfFN mRNA的表達與患者性別、年齡、腫瘤大小無相關性,而與淋巴結轉移和TNM分期顯著相關(P=0.009、P=0.015和P=0.024、P=0.08)。

    表1 OnfFN和TMPRSS4表達與甲狀腺癌臨床病理參數(shù)的關系

    3 討論

    TMPRSS4功能上具有胰酶活性,可能在腫瘤的轉移和浸潤過程中起重要作用,除了胰腺癌在其它惡性腫瘤中TMPRSS4表達水平也提高,例如胃癌、結腸癌和直腸癌等,在軟組織肉瘤和乳腺癌中不表達,在正常的心、腦、肺、肝、骨骼肌、胎盤、子宮和脂肪組織中不表達,而在正常消化道和泌尿生殖道中微量表達。由此可見,TMPRSS4表達存在著組織特異性和腫瘤特異性,并且這種表達的提高不出現(xiàn)在炎癥組織中,這些都表明它與腫瘤有著密切的關系[1]。關于TMPRSS4在甲狀腺癌中的表達情況研究的很少,Electron Kebebew等[2]通過cDNA微陣列技術篩選出差異表達基因TMPRSS4,并經(jīng)過定量RT-PCR驗證發(fā)現(xiàn),它在甲狀腺癌中的高度表達,尤其是在濾泡樣癌和乳頭狀癌濾泡亞型中高度表達,但表達水平與原發(fā)腫瘤大小及淋巴結是否轉移無關。本實驗研究結果顯示:TMPRSS4 mRNA在甲狀腺癌中的表達量高于甲狀腺良性腫瘤, TMPRSS4表達與腫瘤患者性別、年齡及腫瘤大小無關,而與淋巴結是否轉和TNM分期有關,在有淋巴結轉移和TNM Ⅲ+Ⅳ期的標本中的表達水平要高于無淋巴結轉移和TNMⅠ+Ⅱ期的組織,說明TMPRSS4在甲狀腺癌的轉移和進展過程中可能起到了至關重要的作用。

    癌胚纖維連接蛋白(onfFN)是1個相對分子量為(310~335)×103的糖蛋白,正常情況下由子宮內皮下的滋養(yǎng)層細胞和胚胎細胞分泌,作為胎盤的生物膠存在,在妊娠早期存在,而37周以后就會減少[3]。病理情況下在某些腫瘤組織細胞中高度表達,而在正常成人組織中不表達或微量表達,不同的腫瘤組織中表達也存在著明顯的差異,與腫瘤的侵襲和轉移關系密切。很多研究表明,onfFN在多種惡性腫瘤中高度表達,例如在肺癌、子宮等[4,5]中都有表達。在甲狀腺癌中它的表達水平同樣升高,E Hesse等[6]應用cDNA微陣列技術,篩選出甲狀腺癌中onfFN的表達存在差異,應用RT-PCR也證實了這一差異,發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)中陽性率為98%,在甲狀腺濾泡癌(FTC)陽性率為78%。同時,監(jiān)測了外周血中正常細胞的表達情況,發(fā)現(xiàn)在正常的血細胞中無onfFN表達,這些說明通過檢測外周血中onfFN的表達可以用于甲狀腺微小轉移的監(jiān)測,將腫瘤組織的殘留降到最低,同時還可以用于評估惡性腫瘤治療方案的效果。本實驗結果表明,onfFN mRNA在甲狀腺癌中的表達量要高于良性甲狀腺病變,同時,onfFN表達與腫瘤患者性別、年齡、腫瘤大小無關,而與患者有無淋巴結轉移及TNM分期相關,有淋巴結轉移和TNM Ⅲ+Ⅳ期標本中onfFN表達要高于無淋巴結轉移和TNMⅠ+Ⅱ期組織,并且onfFN與TMPRSS4在甲狀腺癌中的表達呈正相關,說明onfFN與TMPRSS4一樣可能在甲狀腺癌的進展和轉移過程中起到一定的作用,而且在此過程中兩者起到了協(xié)同作用。

    隨著現(xiàn)代分子生物學技術的不斷發(fā)展,對甲狀腺癌分子標志物的研究會越來越深入,相信它在臨床的應用前景非常廣闊,尤其是與細針吸細胞學檢查聯(lián)合后,對甲狀腺病變的術前診斷和鑒別診斷具有很高的臨床實用價值,為臨床制定治療方案提供準確的信息。

    [1]Wallrapp C,Hahnel S,Muller-Pillasch F,et al.A novel transmembrane serine protease(TMPRSS3)overexpressed in pancreatics cancer〔J〕.Cancer Research,2000,60(10):2602.

    [2]Electron Kebebew MD,Miao Peng MD.ECM1 and TMPRSS4 are diagnostic markers of malignant thyroid neoplasms and improve the accuracy of fine needle aspiration biopsy〔J〕.Annals of Surgery,2005,242(3):353.

    [3]Moore,Mary LouPhD,Rnc,et al.Biochemical Markers for P-reterm Labor and Birth:What is their role in the care of pregnant women?〔J〕.Lippincott Williams & Wilkins,1999,24(2):80.

    [4]Nanki N,Fujita J,Yang Y,et al.Expression of oncofetal fibronectin and syndecan-1 mRNA in 18 human lung cancer cell lines〔J〕.Tumour Biol,2001,22(6):390.

    [5]Menzin AW,Loret de Mola JR,Bilker WB,et al.Identification of oncofetal fibronectin in patients with advanced epithelial ovarian cancer:detection in ascitic fluid and localization to primary sites and metastatic implants〔J〕.Cancer,1998,82(1):152.

    [6]E Hesse,PB Musholt,E Potter,et al.Oncofoetal fibronectin-a tumour-specific marker in detecting minimal residual disease in differentiated thyroid carcinoma〔J〕.British Journal of Cancer ,2005,93:565.

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