藤梨根誘導(dǎo)人食管癌Eca-109細胞凋亡的調(diào)節(jié)機制

國宏莉 李江華 李 斌 度長海 張 麗

藤梨根又稱陽桃根，為植物獼猴桃科藤梨(軟棗獼猴桃)Actinidia arguta(Sieb.teZucc.)Planch或獼猴Achinensis Planch的根。近年來，藤梨根的抗腫瘤作用引起了國內(nèi)外部分學(xué)者的關(guān)注，并在構(gòu)效分析研究的指導(dǎo)下獲得了許多腫瘤細胞毒活性明顯提高的衍生物[1～3]。因此，了解藤梨根抗腫瘤作用的機制對于評價藤梨根及其衍生物作為抗腫瘤藥物開發(fā)的潛力和指導(dǎo)衍生物的合成具有重要意義。我們前期研究表明藤梨根能明顯抑制人食管癌Eca-109細胞的生長，并能誘導(dǎo)細胞凋亡[4]。但細胞凋亡的機制尚不清楚，這引起了我們極大的興趣。本研究中，我們將對藤梨根誘導(dǎo)人食管癌Eca-109細胞凋亡，凋亡與Bax、Bcl-2蛋白表達及Caspase活化的關(guān)系進行探討。

1 材料與方法

1.1 細胞株與細胞培養(yǎng)

人食管癌細胞Eca-109細胞株購于上海市中科院細胞庫，細胞在含10％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，24 h換液1次。

1.2 試劑和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基購于武漢天源生物技術(shù)有限公司，為Gibco公司產(chǎn)品(貨號31800-022)；超級新生牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品(批號050126)；實驗用1∶250胰酶購于武漢天源生物技術(shù)有限公司，為Difco公司產(chǎn)品(批號020411)；四甲基偶氮唑藍(MTT)購于武漢天源生物技術(shù)有限公司，為Duchefa分裝(貨號BS0880)；二甲亞砜(DMSO)購于武漢天源生物技術(shù)有限公司，為Sigma公司產(chǎn)品。Bax、Bcl-2及Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9相關(guān)蛋白均購于福州邁新生物技術(shù)有限公司。藤梨根正丁醇藥液(以下簡稱藤梨根)由湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)部新藥研制中心提供(500 ml，1 g/ml，pH=3.8)，使用時用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋到1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml等藥物濃度。酶標(biāo)儀(美國Biotech公司Powerwave型)；CO2培養(yǎng)箱(德國Binder CB150型)；數(shù)碼相機(日本尼康coolpix 4500型)；Motic 6.0 1 000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)(廈門麥克奧迪有限公司)。

1.3 MTT法

將貼壁細胞用0.25％的胰蛋白酶消化后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為4×104個/ml，接種于96孔板，待24 h細胞貼壁后加入藤梨根正丁醇藥液。實驗組分別加入終濃度為1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml等藥物濃度的藥液，對照組加入等體積溶劑的培養(yǎng)液，每組12復(fù)孔，分別于加藥后第1、2、3 d等時間后測定各孔的吸光度值(A值)。測定前每孔加5 mg/ml的MTT 20 μl，溫育4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl/孔。同時振蕩至結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長下測定A490值。用各組的平均A值計算細胞生長抑制率。

生長抑制率=對照組A490-實驗組A490對照組A490×100％

1.4 免疫細胞化學(xué)SP法及圖像分析

將濃度為4×104個/ml的Eca-109細胞接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的清凈蓋玻片上，用RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5％CO2條件下，在24孔板中培養(yǎng)24 h后取出蓋玻片，PBS沖洗3次。0.1％Triton-100破膜﹑4％多聚甲醛固定，經(jīng)H2O2阻斷﹑血清封閉后，滴加50 μl一抗，PBS代替一抗作好陰性對照，4℃冰箱過夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗，PBS沖洗3次。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，DAB顯色。蘇木精復(fù)染，鹽酸分化，氨水返藍，中性樹膠封片。結(jié)果判斷：每張細胞爬片隨機選取5個不同部位，顯微鏡下拍照，用Motic 6.0高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)對陽性細胞進行分析，測定陽性細胞的灰度值或光密度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 藤梨根對人食管癌Eca-109細胞生長的影響

藤梨根對人食管癌Eca-109細胞生長的影響見圖1。結(jié)果顯示，當(dāng)用1 μg/ml的正丁醇提取物作用24 h，細胞生長抑制率為18.5％；當(dāng)延長至72 h時，抑制率上升至45.3％ ；而用100 μg/ml的藥物作用72 h時，可使85％以上的細胞生長受到抑制。結(jié)果表明，藤梨根對人食管癌Eca-109細胞的生長抑制作用，隨著藥物濃度的升高和作用時間的延長而增強。

圖1 藤梨根對人食管癌Eca-109細胞生長抑制作用

2.2 藤梨根對人食管癌Eca-109細胞Bax及Bcl-2表達的影響

藤梨根對人食管癌Eca-109細胞Bax及Bcl-2表達的影響見圖2、3。結(jié)果顯示，藤梨根對腫瘤細胞作用24﹑48﹑72 h后分別與對照組比較，用藥組Bax蛋白表達明顯增強(P<0.01)，同時伴Bcl-2表達的改變；空白對照組細胞Bcl-2蛋白表達水平最高即平均灰度值最小，胞質(zhì)著色的細胞數(shù)最多且呈深棕色。用藥24 h后Bcl-2蛋白表達開始減弱，48 h后其表達量與對照組比較，差異有顯著意義(P<0.05)，72 h后降低更為明顯(P<0.01)。

2.3 藤梨根對Eca-109細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達的影響

藤梨根對Eca-109細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達的影響見表1。結(jié)果顯示，用1 μg/ml藤梨根對腫瘤細胞作用24 h時，Caspase-8表達未見明顯改變，Caspase-3、Caspase-9表達稍增強；作用48﹑72 h后，用藥組Caspase-3、Caspase-9表達逐漸增強。100 μg/ml藤梨根作用72 h時，兩組Caspase-3、Caspase-9表達均明顯增強(P<0.01)。

圖2 藤梨根對人食管癌Eca-109細胞Bax蛋白表達的作用

圖3 藤梨根對人食管癌Eca-109細胞Bcl-2蛋白表達的作用

表1 藤梨根對人食管癌Eca-109細胞Caspase-8、Caspase-9及Caspase-12蛋白表達的作用(光密度,±s)

表1 藤梨根對人食管癌Eca-109細胞Caspase-8、Caspase-9及Caspase-12蛋白表達的作用(光密度,±s)

基因24h48h72hCaspase?8 1μg/ml0．100±0．0150．112±0．0110．121±0．014 10μg/ml0．114±0．0130．125±0．0160．126±0．011 100μg/ml0．115±0．0070．125±0．0170．138±0．020? 空白對照0．106±0．0130．116±0．0120．121±0．015Caspase?9 1μg/ml0．114±0．013?0．134±0．021?0．151±0．013? 10μg/ml0．145±0．015?0．172±0．016?0．197±0．009? 100μg/ml0．167±0．010?0．201±0．012?0．228±0．017? 空白對照0．100±0．0110．112±0．0130．120±0．016Caspase?3 1μg/ml0．104±0．0090．125±0．011?0．146±0．015? 10μg/ml0．111±0．0130．135±0．020?0．187±0．020? 100μg/ml0．115±0．0170．152±0．017?0．217±0．014? 空白對照0．105±0．0100．115±0．0210．122±0．018

與對照組比較*為P<0.05；**為P<0.01

3 討論

細胞凋亡是由基因編碼控制的1種細胞的程序性死亡，是機體維持正常生理活動所必需的。近年發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅與細胞增殖有關(guān)，亦與細胞凋亡有關(guān)。凋亡基因精確調(diào)控凋亡過程。目前認為至少有3條通路參與凋亡的發(fā)生即傳統(tǒng)信號傳導(dǎo)通路、死亡受體通路( death receptor pathway)和線粒體通路(mitochondrial pathway)通路，各條通路間又有串話(cross talking)，共同促進細胞凋亡。3條凋亡通路最終都激活Caspase，但Caspase基因敲除實驗表明細胞存在凋亡的代償通路[5，6]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族及Caspase家族在介導(dǎo)細胞凋亡的線粒體通路中起著非常重要的作用[7～9]。部分研究顯示藤梨根能增強肺組織促凋亡細胞因子如heme oxygenase-1、foxp3,TGF-β1等的表達，亦有報道顯示能下調(diào)BCL-2：BAX mRNA的轉(zhuǎn)錄率[10，11]。本研究表明，藤梨根不同藥物濃度1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml作用于Eca-109細胞24﹑48﹑72 h后，有明顯的凋亡特征。MTT法檢測到藤梨根能明顯抑制Eca-109細胞的生長；免疫組化SP法檢測Bax及Bcl-2蛋白的表達，與對照組比較用藥組Bax蛋白表達增強，Bcl-2表達減弱；而同時伴有Caspase-3及Caspase-9蛋白表達明顯增強。因此，我們推測誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡可能是藤梨根抗腫瘤作用的機制之一，它可能通過線粒體通路發(fā)揮作用。而研究中我們也觀察到Caspase-8的輕度增強，這說明細胞凋亡并不完全是個線性通路，或者藤梨根同時啟動了幾種途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。

凋亡發(fā)生時BH - 3 only 亞族蛋白和Bax 亞族蛋白相互作用，促使Bax 亞族蛋白寡聚化，并進入線粒體，促使線粒體釋放細胞色素c 和Smac/ DIABLO，細胞色素c 釋放出來后，和凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease activating factor,Apaf-1)結(jié)合，使Apaf-1寡聚化，激活procaspase- 9、 Caspase-9 激活下游的procaspase -3 及其它的executioner Caspase，引起凋亡。而死亡受體途徑是通過激活FADD ，由死亡效應(yīng)域(death effector domain ,DED)與procaspas 8 的前導(dǎo)區(qū)的DED 結(jié)合，激活procaspase 8。隨后Caspase-8 又激活下游的procaspase3 及其他Caspase 家族的executioner Caspase，引起凋亡。

細胞凋亡中信號分子間相互影響，構(gòu)成了細胞凋亡的環(huán)形通路—死亡環(huán)[12]。在這個死亡環(huán)里，Caspase、Bcl-2 、細胞色素相互作用：細胞色素能激活procaspase ，而有活性的Caspase 也能刺激線粒體釋放細胞色素C。這樣，上游分子和下游分子的凋亡信號呈級聯(lián)放大效應(yīng)。而Bcl-2 既能在細胞色素上游，也能在其下游發(fā)揮作用。阻斷這種環(huán)形放大的級聯(lián)效應(yīng)，從而有效的抑制細胞凋亡。

本研究顯示，藤梨根誘導(dǎo)Eca-109細胞凋亡中線粒體介導(dǎo)的內(nèi)部凋亡通路中的上游關(guān)鍵酶Caspase-9和下游的效應(yīng)分子Caspase-3均被激活，而且Caspase-3的激活伴隨Casapase-9的活化，這不僅提供了藤梨根誘導(dǎo)Eca-109細胞凋亡作用的基礎(chǔ)資料，而且為食管癌的防治提供了新的線索。

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