夜光蟲(chóng)細(xì)胞發(fā)光光質(zhì)檢測(cè)及來(lái)源分析

曹 恒 ，韓 晶，劉衛(wèi)東 ，李桂娟，曹旭鵬

（1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所海洋生物產(chǎn)品工程組，遼寧 大連116023；2.大連測(cè)控技術(shù)研究所，遼寧 大連116013；3.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023）

夜光蟲(chóng)細(xì)胞發(fā)光光質(zhì)檢測(cè)及來(lái)源分析

曹 恒1，韓 晶2，劉衛(wèi)東3，李桂娟2，曹旭鵬1

（1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所海洋生物產(chǎn)品工程組，遼寧 大連116023；2.大連測(cè)控技術(shù)研究所，遼寧 大連116013；3.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023）

夜光蟲(chóng)（Noctiluca scintillans）是一類(lèi)生活在海水中的原生動(dòng)物，同時(shí)也是重要的赤潮生物，自20世紀(jì)90年代以來(lái)，赤潮的光譜遙感預(yù)報(bào)和監(jiān)測(cè)就得到了關(guān)注，但是夜光蟲(chóng)赤潮的光譜遙感準(zhǔn)確度尚有不足。這主要是因?yàn)槟壳皩?duì)夜光蟲(chóng)自身發(fā)光光質(zhì)的認(rèn)識(shí)不足。因此希望在細(xì)胞水平上分析確認(rèn)夜光蟲(chóng)的熒光及其可能成因。在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)夜光蟲(chóng)進(jìn)行純培養(yǎng)，檢測(cè)前改變飼喂方法，已獲得具有不同體內(nèi)食物顆粒的夜光蟲(chóng)。利用倒置熒光顯微鏡、攝譜儀和時(shí)間分辨熒光光譜儀對(duì)單細(xì)胞水平上夜光蟲(chóng)熒光進(jìn)行檢測(cè)。夜光蟲(chóng)具有光激發(fā)熒光（紅光）和相應(yīng)刺激后的自發(fā)化學(xué)熒光（藍(lán)綠光）兩類(lèi)熒光，其中光激發(fā)熒光與其吞噬的微藻色素?zé)晒庀嗤?。夜光蟲(chóng)發(fā)光主要包括以光輻照為基礎(chǔ)的光激發(fā)熒光和以物理刺激為基礎(chǔ)的化學(xué)熒光兩類(lèi)，其中光激發(fā)熒光來(lái)源與夜光蟲(chóng)捕食的藻類(lèi)，而化學(xué)熒光是夜光蟲(chóng)所特有的熒光。夜光蟲(chóng)發(fā)光光質(zhì)的研究，能夠?yàn)楹罄m(xù)的遙感技術(shù)發(fā)展提供基礎(chǔ)生物學(xué)信息。

夜光蟲(chóng)；熒光；生物發(fā)光；光質(zhì)；遙感；赤潮

夜光蟲(chóng)（Noctiluca scintillans），又被稱(chēng)為夜光藻，是一類(lèi)生活在水中的原生動(dòng)物，在分類(lèi)上隸屬于原生動(dòng)物門(mén)（Protozoa）/甲藻門(mén)（Pyrrhophyta）、鞭毛蟲(chóng)綱（Mastigophora）/甲藻綱（Dinofhyceae）、腰鞭毛目（Dinoflagellida）/裸甲藻目（Gymnodiniales），是近岸廣泛分布物種。也有人把Noctiluca scintillans稱(chēng)為Noctiluca miliaris Suriray[1]。夜光蟲(chóng)分布極廣，除寒帶海域外，幾乎遍及世界各海區(qū)，尤其是河口附近的數(shù)量更大，全年均可采集獲得[1-2]，同時(shí)也是最重要的赤潮生物之一，其赤潮發(fā)生頻率和范圍均相當(dāng)高[3-4]。作為一種異養(yǎng)生物，夜光蟲(chóng)沒(méi)有葉綠體，以吞噬其它生物或微小顆粒為生，如浮游植物（如四爿藻[3]）、藍(lán)藻、水蚤的卵、小的魚(yú)卵等[5]。

夜光蟲(chóng)因其在夜間受海水波動(dòng)刺激能發(fā)光得名，當(dāng)大量夜光蟲(chóng)由于海浪、魚(yú)群或者船舶擾動(dòng)發(fā)光，海面星光萬(wàn)點(diǎn)，似絢麗多彩的禮花，這一現(xiàn)象被稱(chēng)為“海火”。在針對(duì)夜光蟲(chóng)發(fā)光的科學(xué)研究方面，早在1810年，Surirary就報(bào)道了在英吉利海峽中夜光蟲(chóng)的發(fā)光現(xiàn)象，在1917年Ethel Browne報(bào)道除了機(jī)械力刺激，電、化學(xué)、熱、震動(dòng)的刺激都能引發(fā)夜光蟲(chóng)產(chǎn)生熒光[6]。隨著顯微技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)，夜光蟲(chóng)受刺激時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中一種絲狀排列的發(fā)光顆粒能夠發(fā)出淡藍(lán)色熒光，其發(fā)光持續(xù)時(shí)間約100 ms[7]。此外，夜光蟲(chóng)含有在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生藍(lán)綠熒光的顆粒物質(zhì)[7]。

近年來(lái)，隨著近岸海水富營(yíng)養(yǎng)化的加劇，赤潮發(fā)生頻率和影響范圍日益嚴(yán)重，造成巨大的損失。作為主要的赤潮生物之一，夜光蟲(chóng)赤潮的預(yù)報(bào)一直為人們所關(guān)注。目前光譜遙感技術(shù)的發(fā)展使得通過(guò)遙感技術(shù)預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)赤潮的發(fā)生成為可能。光譜遙感技術(shù)具有大面積、同步成像和相對(duì)廉價(jià)的優(yōu)勢(shì)。目前遙感監(jiān)測(cè)赤潮主要是依靠對(duì)葉綠素及其它附屬色素的檢測(cè)，表現(xiàn)在光譜曲線上即吸收峰位置、反射峰位置和吸收深度不同，已能夠成功的識(shí)別如丹麥細(xì)柱藻、紅色中縊蟲(chóng)，但遺憾的是目前光譜遙感技術(shù)對(duì)夜光蟲(chóng)識(shí)別精度不高[8]。

光譜遙感技術(shù)對(duì)夜光蟲(chóng)識(shí)別精度不高的一個(gè)可能原因是對(duì)夜光蟲(chóng)發(fā)光的特征了解不足。盡管對(duì)夜光蟲(chóng)發(fā)光的研究已經(jīng)超過(guò)100 a，但是已有研究主要集中在夜光蟲(chóng)的發(fā)光機(jī)制上，關(guān)于夜光蟲(chóng)發(fā)光光質(zhì)等的介紹鮮有報(bào)道。本文將通過(guò)利用熒光顯微鏡、攝譜儀和熒光光譜儀對(duì)夜光蟲(chóng)受激發(fā)光光質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，希望能夠?yàn)楣庾V遙感預(yù)報(bào)和檢測(cè)夜光蟲(chóng)赤潮提供基礎(chǔ)生物學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 材料

通過(guò)浮游生物網(wǎng)在大連周邊海域采集水下10 m至表層的夜光蟲(chóng)樣本，室溫條件下（23～25°C）靜置約 1 h，夜光蟲(chóng)浮于表面。用玻璃吸管收集表層的夜光蟲(chóng)，放入經(jīng)過(guò)0.33 μm中空纖維超濾的天然海水中，分兩組在16°C進(jìn)行培養(yǎng)，一組喂食亞心形四爿藻（Tetraselmis subcordiformis），其濃度為4×105cells/mL，每?jī)商焱段挂淮巍?duì)照組不喂食以消耗其自身的食物顆粒。

1.2 儀器

利用連接有數(shù)字圖像采集系統(tǒng)的尼康Eclipse TE2000U倒置熒光顯微鏡對(duì)夜光蟲(chóng)不同激發(fā)波段下的熒光進(jìn)行觀察，所使用的濾鏡為 UV-2A（330～380 nm），B-2A（450～490 nm）和 G-2A（510～560 nm）。

攝譜儀可以捕捉設(shè)定譜段內(nèi)的各個(gè)波長(zhǎng)的發(fā)光強(qiáng)度，但是對(duì)于夜光蟲(chóng)這種微弱電光源捕捉的靈敏度和準(zhǔn)確度不高，因此利用7IGF10定光柵攝譜儀 （北京賽凡光電儀器有限公司）對(duì)夜光蟲(chóng)熒光全光譜進(jìn)行捕捉，確定其發(fā)光的主要譜段。

在攝譜儀檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用FLS920時(shí)間分辨熒光光譜儀（Edinburgh Instruments,UK）的激發(fā)光掃描功能對(duì)鼓泡情況下夜光蟲(chóng)受激發(fā)射熒光進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 試劑

實(shí)驗(yàn)中使用的天然海水為大連10 m深處近岸海水，經(jīng)沉淀、沙濾后使用0.33 μm中空纖維超濾系統(tǒng)（大連天邦）過(guò)濾除菌。

餌料四爿藻為實(shí)驗(yàn)室自行培養(yǎng)，使用前通過(guò)離心去除培養(yǎng)基。

1.4 操作

1.4.1 熒光圖像采集

將10個(gè)喂食培養(yǎng)5 d的夜光蟲(chóng)收集到1 mL海水中，平鋪在載玻片上，室溫條件下分別在可見(jiàn)、紫外、藍(lán)光和綠光4種光源下進(jìn)行觀察，使用顯微鏡隨機(jī)附帶軟件以自動(dòng)模式進(jìn)行拍照。同時(shí)以不喂食四爿藻的夜光蟲(chóng)作為對(duì)照。

1.4.2 物理刺激下夜光蟲(chóng)發(fā)光光質(zhì)測(cè)定

因?yàn)橐构庀x(chóng)在水流、氣泡的影響下會(huì)產(chǎn)生藍(lán)綠光，因此這里對(duì)氣泡影響下的夜光蟲(chóng)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。

在450～550 nm范圍內(nèi)利用攝譜儀進(jìn)行光質(zhì)檢測(cè)，獲得夜光蟲(chóng)自身受激發(fā)光的初步信息。將約30個(gè)夜光蟲(chóng)收集到2 mL天然海水中，放入1 cm比色杯。將攝譜儀光纖探頭固定于比色杯口處，同時(shí)將輸液器針頭插入液面下方。用鋁箔紙將比色杯、針頭與探頭包裹形成避光環(huán)境。室溫條件下，向比色杯內(nèi)鼓空氣刺激熒光產(chǎn)生，通氣速率量約20 mL/min。攝譜儀曝光時(shí)間10 s。

將約30個(gè)夜光蟲(chóng)放入1 cm比色杯中，將注射器針頭插入液面下并通過(guò)輸液管引出熒光光譜儀，手動(dòng)進(jìn)行鼓泡，通氣速率量約20 mL/min空氣。熒光儀以5 nm/s的速度在450～550 nm范圍內(nèi)對(duì)夜光蟲(chóng)熒光進(jìn)行掃描檢測(cè)。

獲得的光質(zhì)數(shù)據(jù)導(dǎo)入OriginPro（version 8.1 SR3,Origin-Lab Corporation）進(jìn)行分析、作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光圖像分析

圖1 夜光蟲(chóng)和其內(nèi)部吞噬的微藻

保持喂食的夜光蟲(chóng)在可見(jiàn)光下能清楚的看到細(xì)胞內(nèi)部具有大量的食物，其中四爿藻的形態(tài)可以辨識(shí)（圖1）。

圖2 不同激發(fā)光條件下夜光蟲(chóng)熒光

在不同激發(fā)光波長(zhǎng)條件下，夜光蟲(chóng)及其內(nèi)部的四爿藻呈現(xiàn)出不同的熒光。由于夜光蟲(chóng)自身運(yùn)動(dòng)影響，可見(jiàn)光與熒光圖中相對(duì)位置略有差異，但是不難看出，在不同激發(fā)光條件下，夜光蟲(chóng)表面粘附及被吞噬在夜光蟲(chóng)內(nèi)部的四爿藻均呈現(xiàn)出紅色（圖2）。相比之下，對(duì)照組的夜光蟲(chóng)內(nèi)部只有少量紅色熒光（圖3）。

夜光蟲(chóng)細(xì)胞質(zhì)只有在紫外條件下有明顯的藍(lán)色熒光（圖2、圖3）。熒光來(lái)源于夜光蟲(chóng)內(nèi)部的顆粒狀物質(zhì)，與文獻(xiàn)中報(bào)道[7]一致。

2.2 光質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

攝譜儀同時(shí)檢測(cè)整個(gè)待測(cè)波長(zhǎng)范圍，可能因?yàn)椴⒉贿m用于微弱電光源的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果信噪比低，但是能夠看出在498 nm附近有最強(qiáng)的夜光蟲(chóng)發(fā)光產(chǎn)生（圖4左上）。熒光光譜儀的檢測(cè)靈敏度高，在501 nm處有最高吸收，信噪高。但是熒光光譜儀屬于掃描型檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)可能與夜光蟲(chóng)發(fā)光不同步，因此所獲得的檢測(cè)峰對(duì)稱(chēng)性稍有欠缺（圖4）。結(jié)合這兩種檢測(cè)的結(jié)果，夜光蟲(chóng)在物理刺激下發(fā)出的熒光應(yīng)該在500 nm±5 nm。

3 討論

作為一種異養(yǎng)生物，正常狀態(tài)下夜光蟲(chóng)自身細(xì)胞質(zhì)內(nèi)沒(méi)有色素或者色素很少，呈透明狀。但是當(dāng)夜光蟲(chóng)生長(zhǎng)到一定的種群密度或者由于其它原因使其聚集則逐漸變?yōu)榉奂t色，形成赤潮。因此，夜光蟲(chóng)在赤潮形成之前，自身的顏色可能難以被用來(lái)進(jìn)行光譜遙感預(yù)報(bào)。但是夜光蟲(chóng)的兩個(gè)特點(diǎn)為我們進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)提供了可能。一種是夜光蟲(chóng)由于吞噬食物顆粒的色素而具有顏色，另一種是夜光蟲(chóng)自身受刺激后發(fā)光。

圖3 對(duì)照組未喂食夜光蟲(chóng)紫外下的熒光照片

從本實(shí)驗(yàn)中可以看出，由于夜光蟲(chóng)大量進(jìn)食四爿藻，未徹底消化的四爿藻體內(nèi)的葉綠素等色素在紫外、藍(lán)、綠光激發(fā)下均呈現(xiàn)出紅色熒光，并且強(qiáng)度很高。從實(shí)際采樣過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)部分夜光蟲(chóng)體內(nèi)具有微藻等含有色素的食物顆粒，由于已有的光譜遙感工作中[8]，通常使用葉綠素?zé)晒庾鳛闄z測(cè)譜段，因此在自然條件下這將導(dǎo)致難以區(qū)分夜光蟲(chóng)為主的赤潮和夜光蟲(chóng)餌料藻引發(fā)的赤潮。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，夜光蟲(chóng)自身受紫外激發(fā)會(huì)產(chǎn)生明亮的藍(lán)色熒光。這部分熒光應(yīng)該具有很好的夜光蟲(chóng)種屬特異性。在參考文獻(xiàn)[8]中也介紹400～585 nm段，光譜遙感數(shù)據(jù)對(duì)夜光蟲(chóng)有較好的識(shí)別能力，只是結(jié)合了葉綠素?zé)晒庾V段后，發(fā)生錯(cuò)誤的識(shí)別。

圖4 夜光蟲(chóng)物理刺激下熒光光譜

因此，在基于日光的光譜檢測(cè)（激發(fā)、吸收、反射燈）之外，尋找夜光蟲(chóng)特征性的檢測(cè)指標(biāo)對(duì)于提高遙感識(shí)別夜光蟲(chóng)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用攝譜儀和熒光光譜儀對(duì)夜光蟲(chóng)自身作為應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)光光質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)夜光蟲(chóng)自身受激發(fā)光為500 nm附近的藍(lán)綠光，不需要額外光源。僅管在實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，無(wú)論白天黑夜夜光蟲(chóng)都有熒光的產(chǎn)生，但是在白天受日光的影響，這部分熒光太過(guò)微弱難以有效的從背景中分離并進(jìn)一步應(yīng)用，在夜晚，由于外界光源減弱，有可能通過(guò)遙感技術(shù)對(duì)此進(jìn)行檢測(cè)，并用以和其它光譜遙感數(shù)據(jù)相結(jié)合，作為預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)夜光蟲(chóng)赤潮的一個(gè)指標(biāo)，應(yīng)該能夠提高光譜遙感檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

[1]杞桑，江天久.中國(guó)沿海的夜光蟲(chóng)和夜光蟲(chóng)赤潮概述[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)論叢，1995（3）：244-245.

[2]張?zhí)煳?，朱麗巖，徐培培，等.膠州灣夜光蟲(chóng)豐度的季節(jié)變化和分布特征[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009，39(S1)：89-93.

[3] 吳玉霖，周成旭，張永山.夜光藻的室內(nèi)培養(yǎng)[J].海洋與湖沼，1994，25（2）：165-167.

[4] 周成旭，吳玉霖，鄒景忠.夜光藻的營(yíng)養(yǎng)動(dòng)力學(xué)[J].海洋與湖沼，1994，25（2）：152-157.

[5]Balch W M，Haxo F T.Spectral properties of Noctiluca miliaris Suriray,a heterotrophic dinoflagellate [J].Journal of Plankton Research,1984,6(3)：515-525.

[6]Eckert R.Bioelectric control of bioluminescence in the dinoflagellate Noctiluca[J].Science,1965,147：1140-1145.

[7]Eckert R， Reynolds G T.The subcellular origin of Bioluminescence in Noctiluca miliaris [J].The journal of General Physiology,1967,50(5)：1429-1457.

[8]馬毅.赤潮航空高光譜遙感探測(cè)技術(shù)研究[D].青島：中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，2003.

Detection and Characterization of Bioluminescence of Noctiluca Scintillans

CAO Heng1,HAN Jing2,LIU Wei-dong3,LI Gui-juan2,CAO Xu-peng1
(1.Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian Liaoning 116023,China;2.Dalian Scientific Test&Control Technology Institute,Dalian Liaoning 116013,China;3.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute,The Key Laboratory of Marine Fishery Molecular Biology of Liaoning Province,Dalian Liaoning 116023,China)

Noctiluca scintillans is widely distributed throughout the world,occurring most often in coastal waters.N.scintillans is also a major source of red tide.Since 1990s,the forecast and monitoring of red tide by way of remote sensing has drawn more attention,but there is still problem in the precision of identifying N.scintillans.It is necessary to analyze the bioluminescence cause from the cell level.The method of cultivating N.scintillans in the lab to detect using fluorescence microscope,spectrograph meter and fluorescence spectrometer is adopted.There are two type of bioluminescence of N.scintillans,sunlight induced fluorescence derived from the preyed alga and chemi-luminescence induced by mechanical stimulation.It’s hoped to contribute some basic biology information for the further development of N.scintillans dominant red tide by remote sensing.

Noctiluca scintillans;fluorescence;bioluminescence;spectrum;remote-sensing;red-tide

Q89

A

1003-2029（2011）03-0009-04

2011-05-04

水下測(cè)控技術(shù)國(guó)防科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目資助（9140C2603110905）

曹旭鵬(1978-)，男，副研究員，生物化工博士，研究主要包括海洋微藻資源利用，海洋微生物資源利用和生物酶催化。Email:c_x_p@dicp.ac.cn