單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ的基因克隆*

韓寶芹,馮伊琳,畢慶慶,劉萬(wàn)順,隋正紅,楊官品

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東青島266003)

血栓性疾病(腦血栓、冠心病、血栓栓塞性脈管炎、心肌梗塞等)一直嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康,這類(lèi)疾病發(fā)病率高,死亡率高,致殘率高,且疾病發(fā)生率隨人口老齡化程度的加深而提高。據(jù)相關(guān)資料顯示,全世界每年有1750萬(wàn)人死于心腦血管病,我國(guó)心腦血管疾病患者已經(jīng)超過(guò)2.7億人,每年死于心腦血管疾病的患者多達(dá)300萬(wàn),已成為心腦血管病發(fā)病和死亡最嚴(yán)重的國(guó)家[1]。

栓塞性疾病主要有3種治療手段:外科手術(shù),長(zhǎng)期服用抗凝劑,藥物溶栓。其中,溶栓藥物治療的方法最為重要也最具發(fā)展?jié)摿?。目前臨床應(yīng)用的溶栓藥物雖然已經(jīng)發(fā)展到第三代,但很多藥物的療效并不理想,存在著特異性差,副作用重,半衰期短等缺點(diǎn),又或是生產(chǎn)不易,物稀價(jià)昂[2-5],因此,對(duì)于溶栓特異性好,半衰期長(zhǎng),生產(chǎn)制備容易的溶栓劑的開(kāi)發(fā)需求迫切。

本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)多年研究,從海洋無(wú)脊椎動(dòng)物單環(huán)刺螠(Urechis unicinctus)中分離出了1種新型纖溶酶,命名為單環(huán)刺螠纖溶酶(UFE)。該酶包括4個(gè)分子量組分,按照分子量由大到小,分別是單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅰ,單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ,單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅲ和單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅳ。4個(gè)單環(huán)刺螠纖溶酶組分均具有提高受試機(jī)體繼發(fā)性纖溶活性的能力,具有顯著的抗凝活性和纖溶活性以及較好的生物安全性,故具有較大的開(kāi)發(fā)價(jià)值[6-7]。但是從生物體中直接提取,以分離純化的方法進(jìn)行生產(chǎn)存在許多弊端,如生產(chǎn)工藝復(fù)雜,生產(chǎn)質(zhì)量不穩(wěn)定,產(chǎn)率低等。為解決上述問(wèn)題,本研究克隆了該纖溶酶Ⅱ的全長(zhǎng)cDNA序列,并通過(guò)生物信息學(xué)分析,初步確定其編碼的蛋白質(zhì)是1種胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶,為進(jìn)一步開(kāi)展基因工程菌的構(gòu)建,重組活性蛋白的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

單環(huán)刺螠購(gòu)于青島海產(chǎn)品市場(chǎng)。經(jīng)分離純化得到的單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ(分子量26 kDa)純品,本實(shí)驗(yàn)室制備。E.coli DH5α和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司;質(zhì)粒pMD18-T,Ex Taq DNA聚合酶,PrimeScrip t 1st Strand cDNA Synthesis Kit,5′-Full RACE Kit等均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)測(cè)序 單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ蛋白質(zhì)由北京華大蛋白質(zhì)研究中心測(cè)序,得到N-末端序列:ICGGSPAD IT。

1.2.2 單環(huán)刺螠總RNA提取 用酸性酚-異硫氰酸胍法提取整個(gè)蟲(chóng)體總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量[8],并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA第一鏈合成 根據(jù)Prime Scrip t 1st Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行并用設(shè)計(jì)合成的3’RACE Adaptor:5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGA TTTCACTA TAGGTTTTTT TTTTTTTTTT-3’替代試劑盒中自帶的Oligo d T Primer做反轉(zhuǎn)錄引物,得到cDNA第一鏈。

1.2.4 簡(jiǎn)并PCR 根據(jù)已測(cè)定的單環(huán)刺螠纖溶酶ⅡN-端序列ICGGSPAD IT,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并正向引物103:5’-TCNCCNGCNGA YA THAC-3’,104:5’-AGYCCNGCNGA YA THAC-3’,根據(jù)3’RACE Adap tor設(shè)計(jì)反向引物OP:5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGA TTT-3’。擴(kuò)增體系:cDNA模板0.5μL,10×buffer 2.5μL,25mmol/L MgCl23μL,2.5 mmol/LdN TP 2μL,10μmol/L正向引物103/104 2.5μL,10μmol/L反向引物OP 1μL,ddH2O 13.3μL,r Taq DNA聚合0.2μL,總體積25μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收,回收產(chǎn)物與pMD18-T載體16℃過(guò)夜連接得連接載體。將連接載體用42℃熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α,涂布含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)基上的單克隆分別接種入含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)擴(kuò)增,用特異性引物103/104與OP進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆,陽(yáng)性菌株測(cè)序。

1.2.5 5’RACE PCR 根據(jù)5′-Full RACE Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行5’-RACE PCR。所用特異性引物根據(jù)上述簡(jiǎn)并PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì),GSP1:5’-TTTACATGCGTTCGGCAATCCA-3’,GSP2:5’-ATTGTTGTAGTCGCTGTGCTCGTC-3’,擴(kuò)增體系及參數(shù)見(jiàn)說(shuō)明書(shū),其中PCR退火溫度為55℃。其他程序同1.2.4。

1.2.6 單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ基因(ufeⅡ)全長(zhǎng)擴(kuò)增根據(jù)5’RACE PCR測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)正向引物stt:5’-GCGACTCCTGCA TTA TGAAGACTC-3’,根據(jù)簡(jiǎn)并引物PCR測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)反向引物OP:5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGA TTT-3’。擴(kuò)增體系:cDNA模板1μL,TaKaRa Ex Taq 0.25μL,10×Ex Taq Buffer 5μL,2.5mmol/L dN TP4μL,10μmol/L正向引物stt 2μL,10μmol/L反向引物OP 2μL,ddH2O 35.75μL,總體積50μL。擴(kuò)增條件中退火溫度為55℃,其余程序同1.2.4。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 cDNA序列使用NCB I BLASTx程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行比對(duì)分析,使用Bio Edit軟件將cDNA序列翻譯為氨基酸序列,對(duì)推導(dǎo)出的蛋白序列使用NCB I(http:∥www.ncbi,nlm,nih.gov/Structure)保守區(qū)域數(shù)據(jù)庫(kù)CDD(Conserved Domain Database)以及PROSITE的ScanProsite軟件(http://expasy.org/tools/scanp rosite/)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及活性位點(diǎn)預(yù)測(cè),SingalP程序分析信號(hào)肽。不同來(lái)源的絲氨酸蛋白酶家族成員用ClustalW創(chuàng)建1個(gè)多序列的比對(duì)結(jié)果,系統(tǒng)發(fā)生和進(jìn)化的分析在比對(duì)的基礎(chǔ)上用MEGA 4.0軟件完成,系統(tǒng)樹(shù)采用Neighbor_joining方法構(gòu)建,bootstrap值為1 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 單環(huán)刺螠總RNA提取

新鮮蟲(chóng)體提取總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),如圖1所示,可見(jiàn)清晰的28s、18s、5s條帶,無(wú)拖尾,總RNA質(zhì)量良好,可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

圖1 單環(huán)刺螠蟲(chóng)體總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose electrophoresis of total RNA from Urechis unicinctus

2.2 單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ基因(ufeⅡ)全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增

2.2.1 簡(jiǎn)并PCR 以總RNA為模板,3’RACE A dap tor為反向引物,反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA。以此為模板,用引物103和OP擴(kuò)增出大小約800 bp的產(chǎn)物(見(jiàn)圖2)。

圖2 簡(jiǎn)并PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose electrophoresis of degenerated PCR

2.2.2 5’RACE PCR 根據(jù)簡(jiǎn)并PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物,使用5′-Full RACE Kit(TaKaRa)擴(kuò)增得到大小約400 bp的產(chǎn)物(見(jiàn)圖3),測(cè)序結(jié)果與簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果有228個(gè)堿基的重疊。

2.2.3 單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ基因(ufeⅡ)全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增 根據(jù)2次測(cè)序結(jié)果分別設(shè)計(jì)正反向引物擴(kuò)增ufeⅡ全長(zhǎng),得到大小約800 bp的PCR產(chǎn)物(見(jiàn)圖4)。

將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,該測(cè)序結(jié)果結(jié)合3’,5’RACE PCR測(cè)序結(jié)果的末端,得到單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ基因全長(zhǎng)cDNA序列(見(jiàn)圖5)。全長(zhǎng)cDNA為906bp(GenBank accession number HM 623463),其中開(kāi)放閱讀框795 bp。

圖3 5’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose electrophoresis of 5’RACE PCR

圖4 全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose electrophoresis of full length cDNA amplification

圖5 單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ基因及其編碼氨基酸序列方框中依次為:起始密碼子,蛋白質(zhì)N端序列,終止密碼子Fig.5 Nucleo tide sequence and deduced amino acid sequence of the UFE cDNA.Boxes:start codon,protein Nterminal sequence,stopcodon

2.3 單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1 單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ基因同源序列分析BLASTx比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖6。如圖6所示,與本研究得到的序列的編碼產(chǎn)物相似度較高的蛋白質(zhì)為沙躅胰凝乳蛋白酶原,蚓激酶,蚯蚓纖溶酶,孢囊線蟲(chóng)和櫛孔扇貝的絲氨酸蛋白酶等,因單環(huán)刺螠作為1種海洋生物,其基因組具有一定特殊性,故使用核苷酸序列比對(duì)時(shí)未見(jiàn)相似度高的序列。

圖6 單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ與其他蛋白質(zhì)相似性比對(duì)Fig.6 Similarity comparison of amino acid sequence between amplified product and other proteins in database

圖7 利用NJ法繪制的14種絲氨酸蛋白酶家族成員的進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Neighbor-joining phylogenic tree of 14 different Protease amino acid sequences from serine p rotease family

本文比對(duì)了14個(gè)不同的絲氨酸蛋白酶家族成員并計(jì)算了它們的氨基酸相似性,利用M EGA軟件對(duì)這些序列進(jìn)行了分子系統(tǒng)學(xué)分析,在構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的基礎(chǔ)上研究了單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ和其他絲氨酸蛋白酶家族成員之間的進(jìn)化關(guān)系(見(jiàn)圖7)。結(jié)果顯示,不同物種來(lái)源的絲氨酸蛋白酶在一定程度上是相關(guān)的。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上可以看到,單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ在進(jìn)化上與來(lái)源于沙躅的胰凝乳蛋白酶原,以及蚓激酶等來(lái)源于蚯蚓的蛋白酶親緣關(guān)系較近。

2.3.2 單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ基因氨基酸序列保守性在NCB I(http:∥www.ncbi,nlm.nih.gov/Structure)保守區(qū)域數(shù)據(jù)庫(kù)CDD(Conserved Domain Database)中分析單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ氨基酸序列的保守性(見(jiàn)圖8)。結(jié)果顯示該酶屬于胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶家族,通常為無(wú)活性前體酶原形式,經(jīng)過(guò)限制性蛋白酶水解產(chǎn)生有活性的酶,剪切位置在第31-32氨基酸處,預(yù)測(cè)的剪切位置與蛋白質(zhì)N端序列位置吻合。單環(huán)刺螠纖溶酶包含3個(gè)絲氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體),并具有3個(gè)特異性底物結(jié)合位點(diǎn)。

圖8 單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ保守區(qū)分析Fig.8 Conserved domain analysis of UFEⅡ

使用PROSITE的Scan Prosite軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析[9],該蛋白質(zhì)含有1個(gè)tryp sin domain第32-264位,起始位點(diǎn)與蛋白質(zhì)N端位置一致,其中第72位組氨酸(H)、第119位天冬氨酸(D)、第214位絲氨酸(S)為活性位點(diǎn)[10-11]。

2.3.3 單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ基因(ufeⅡ)氨基酸序列信號(hào)肽預(yù)測(cè) 根據(jù)http://cbs.dtu.dk/services/SignalP/中信號(hào)肽分析軟件對(duì)單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ氨基酸序列的分析,目標(biāo)蛋白在第15和16個(gè)氨基酸之間被信號(hào)肽酶酶切的可能性最大,因此單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ的信號(hào)肽應(yīng)該是包含1～15個(gè)氨基酸殘基的N端肽鏈。

2.3.4 單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ分子量預(yù)測(cè) 單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ前體肽氨基酸序列是根據(jù)基因序列推導(dǎo)出的,共有264個(gè)氨基酸,相對(duì)分子量為27030.59 Daltons(EditSeq),是分泌到胞外有活性的單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ的未經(jīng)過(guò)剪切加工的前體肽,根據(jù)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure)保守區(qū)域數(shù)據(jù)庫(kù)CDD(Conserved Domain Database)中分析,剪切后的活性蛋白質(zhì)由32～264位氨基酸組成,即除了切除信號(hào)肽外還經(jīng)過(guò)其它加工,需要再切除16個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽段,分子量為23905.85 Daltons(EditSeq)。

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