吲哚乙酸、萘乙酸對蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘導(dǎo)作用

陳凱峰，鄧 妍，郭建軍，劉中來，祁 超

（華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430079）

植物激素是植物細(xì)胞接受特定環(huán)境信號誘導(dǎo)產(chǎn)生的、可調(diào)節(jié)植物生理反應(yīng)的活性物質(zhì).它們在植物的生長過程中調(diào)控植物的生長、發(fā)育與分化等過程［1］.所以，農(nóng)業(yè)上使用人工合成的激素作用于農(nóng)作物，以達(dá)到農(nóng)產(chǎn)品增產(chǎn)的目的.但隨著劑量逐漸加大，農(nóng)作物污染問題也突顯出來.

農(nóng)藥、重金屬及各類有害物質(zhì)的檢測并不少見，但人工植物激素對植物的損害的研究并不多.微核試驗(yàn)是用來評價(jià)藥物、放射線、有毒物質(zhì)等對人體細(xì)胞或體外培養(yǎng)細(xì)胞遺傳學(xué)損傷的一個(gè)直觀有效可行的方法，在遺傳毒理、醫(yī)學(xué)、食品、藥物、環(huán)境等諸多方面有著廣泛的應(yīng)用［2］.本文選用2種常見植物激素吲哚乙酸、萘乙酸，應(yīng)用微核實(shí)驗(yàn)研究了它們對蠶豆所造的遺傳傷害.

1 材料與方法

1.1 材料

蠶豆（Vicia faba），松滋青皮蠶豆，來源于華中師范大學(xué)生命科學(xué)院.

1.2 試劑

卡諾氏固定液 ，1mol／L HCl，吲哚乙酸，萘乙酸，環(huán)磷酰胺（AR，均購于亦新生物公司）.

1.3 方法［3］

1.3.1 樣品的制備與固定 選擇飽滿、大小均勻的蠶豆種子用清水沖洗干凈，浸泡24h，放置磁盤中用濕紗布覆蓋，25℃恒溫培養(yǎng)，12h換水1次.待根長至1.5～3cm 后，用濃度分別為1、3、5、7、10、20、40、60、80、100mg／L 的吲哚乙酸和萘乙酸處理6h、12h、24h.陽性對照為環(huán)磷酰胺，陰性對照為蒸餾水.處理后，用蒸餾水沖洗3次，每次3min，然后25℃恒溫條件使根尖細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)24h.剪下1cm長的根尖用卡諾氏固定液固定12 h.若固定后的根尖需存儲，需將其轉(zhuǎn)至70%乙醇中于4℃冰箱內(nèi)保存.

1.3.2 染色與制片 固定后，不同濃度處理的根尖隨機(jī)取5個(gè)，用蒸餾水清洗3次，1次5min.放入EP管，加入1mol／L鹽酸，60℃恒溫水解10min.用蒸餾水清洗3次，1次5min.用解剖針在載玻片上將根尖搗碎后，改良苯酚品紅染色10 min，加蓋玻片，輕敲打壓片.

1.3.3 觀察與計(jì)數(shù) 在40倍光學(xué)顯微鏡下，從左向右，隨機(jī)選取清晰的視野.

微核識別：在間期細(xì)胞中，凡在主核大小1／3以下，形態(tài)呈圓形、橢圓形、或不規(guī)則形，與主核分離的小核，并且其著色與主核相似.

每個(gè)根尖觀察至少1 000個(gè)細(xì)胞.記錄有絲分裂數(shù)﹑微核細(xì)胞數(shù)和染色體畸變數(shù).按如下公式計(jì)算：

有絲分裂數(shù)指數(shù)（MI%）＝分裂細(xì)胞數(shù)／觀察細(xì)胞總數(shù)×100%；

微核千分率（MCN‰）＝微核細(xì)胞數(shù)／觀察細(xì)胞總數(shù)×1000‰；

染色體畸率（CAF%）＝染色體數(shù)／觀察細(xì)胞總數(shù)×100%.

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件 對所得數(shù)據(jù)用Origin6.1進(jìn)行方差分析，采用t檢驗(yàn)檢測不同處理組與對照組間的差異顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1 吲哚乙酸、萘乙酸對蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂﹑微核率﹑染色體劑量關(guān)系

由表1，表2可以看出，隨著吲哚乙酸濃度的加大，微核率的增加呈雙波型，在5mg／L、40mg／L時(shí)到達(dá)峰值，所有數(shù)值均大于陰性對照組，有5個(gè)濃度處呈顯著差異（P＜0.05）.有絲分裂指數(shù)在吲哚乙酸濃度≤7mg／L，隨著濃度的增加，逐漸上升，當(dāng)濃度達(dá)10mg／L后開始遞減，低于陰性對照，有6個(gè)濃度處呈顯著差異（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01）.當(dāng)濃度增加到40mg／L時(shí)，又開始回升；有絲分裂指數(shù)在濃度≤7mg／L時(shí)與微核率增加呈正相關(guān)；在濃度≥10mg／L，與微核率增加呈負(fù)相關(guān).染色體畸變在吲哚乙酸濃度≤5mg／L時(shí)，隨著濃度增加而逐漸上升，當(dāng)濃度到達(dá)10mg／L之后驟然下降，有8個(gè)濃度處呈顯著差異（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01）.以上數(shù)據(jù)說明，當(dāng)吲哚乙酸濃度≤7mg／L時(shí)，有絲分裂﹑微核率﹑染色體呈正相關(guān)增長，有一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系.當(dāng)濃度≥10mg／L時(shí)，隨著濃度增加，有絲分裂指數(shù)和染色體畸變降到低于對照組，而后有絲分裂指數(shù)在40～100mg／L回升，微核率卻下降，與有絲分裂指數(shù)呈負(fù)相關(guān).各類染色體畸變見圖1.

隨著萘乙酸濃度的加大，微核率的增加呈雙波型，在3mg／L、40mg／L時(shí)到達(dá)峰值，所有數(shù)值均大于陰性對照組，有3個(gè)濃度處呈顯著差異（P＜0.05）.有絲分裂指數(shù)在萘乙酸濃度≤3mg／L，隨著濃度的增加而增加.在濃度＞3mg／L時(shí)，開始遞減，在濃度≥60mg／L時(shí)，又開始回升.于陰性對照相比，有6個(gè)濃度處呈顯著差異（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01）.染色體畸變隨著萘乙酸濃度的增加，呈波浪型，但總體趨勢是先增后降，有4個(gè)濃度處呈顯著差異（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01）.以上數(shù)據(jù)說明，當(dāng)萘乙酸濃度≤3mg／L時(shí)，有絲分裂﹑微核率﹑染色體呈正相關(guān)增長，有一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系.隨著濃度的增加，有絲分裂指數(shù)和染色體畸變降到低于對照組，而后有絲分裂指數(shù)在40～100mg／L回升，微核率下降，與有絲分裂指數(shù)呈負(fù)相關(guān).各類染色體畸變見圖1.

由兩者植物激素對蠶豆根尖各項(xiàng)指標(biāo)影響的比較，可以看出相似的趨勢：隨著濃度的增加，各項(xiàng)指標(biāo)成波動(dòng)型變化.在濃度較低時(shí)，它們能促進(jìn)細(xì)胞分裂，微核率和染色體畸變率與細(xì)胞分裂指數(shù)呈正相關(guān)，并存在一定劑量－效應(yīng)關(guān)系.濃度較高時(shí)它們能抑制細(xì)胞分裂，微核率和染色體畸變率與之呈負(fù)向關(guān)系，劑量－效應(yīng)關(guān)系不明顯.

2.2 吲哚乙酸、萘乙酸對蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂﹑微核率﹑染色體的時(shí)間關(guān)系

圖2～圖7是用不同濃度的吲哚乙酸、萘乙酸處理蠶豆6h、12h、24h的柱狀圖.可以看出，隨著作用時(shí)間的延長，兩種植物激素對蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂﹑微核率﹑染色體的影響趨勢越來越突出.在12h和24h時(shí)，不同濃度所造成的顯著差異或極顯著差異均高于6h時(shí)，并表現(xiàn)出一定的遺傳損傷.由此也驗(yàn)證了上面所分析的結(jié)果.

表1 不同濃度吲哚乙酸對蠶豆根尖有絲分裂﹑微核率﹑染色體的影響（處理時(shí)間6h）Tab.1 Effects of the different concentrations of IAA on MI，F(xiàn)MN and CAF in the root rip cells of Vicia faba for 6h

表2 不同濃度萘乙酸對蠶豆根尖有絲分裂﹑微核率﹑染色體的影響（處理時(shí)間6h）Tab.2 Effects of the different concentrations of NAA on MI，F(xiàn)MN and CAF in the root rip cells of Vicia faba（6h）

圖1 吲哚乙酸、萘乙酸誘發(fā)的蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變Fig.1 Chromosomal aberrations induced by IAA and NAA in the root rip cells of Vicia faba

圖2 吲哚乙酸對蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂的影響（6h，12h，24h）Fig.2 Effects of the different concentrations and times of IAA on mitosis index in the root rip cells of Vicia faba for 6h，12hand 24h（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

圖3 吲哚乙酸對蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響（6h，12h，24h）Fig.3 Effects of the different concentrations of IAA on micronucleus rate in the root rip cells of Vicia faba for 6h，12hand 24h（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

圖4 吲哚乙酸對蠶豆根尖細(xì)胞染色體的影響（6h，12h，24h）Fig.4 Effects of the different concentrations and times of IAA on chromosomal aberration Vicia faba root rip cells for 6h，12hand 24h（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

圖5 萘乙酸對蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂的影響（6h，12h，24h）Fig.5 Effects of different concentrations of AA on micronucleus rate in the root rip cells of Vicia ba for 6h，12hand 24h（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

圖6 吲哚乙酸對蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響（6h，12h，24h）Fig.6 Effects of different concentrations of NAA on micronucleus rate in the root rip cells of Vicia faba for 6h，12hand 24h（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

圖7 萘乙酸對蠶豆根尖細(xì)胞染色體的影響（6h，12h，24h）Fig.7 Effects of the different concentrations and times of NAA on chromosomal aberration in the root rip cells of ia faba for 6h，12hand 24h（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

3 討論

吲哚乙酸和萘乙酸是常見的植物激素，主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂，加速植物成長.但在濃度稍高時(shí)即會(huì)引起抑制生長的作用，更高濃度即對植物產(chǎn)生毒害作用.在本文中，2種植物激素表現(xiàn)出相一致的趨勢：當(dāng)濃度較低時(shí)，促進(jìn)了細(xì)胞分裂，微核率和染色體畸變率與細(xì)胞分裂指數(shù)呈正相關(guān).根據(jù)微核形成的原理：微核是細(xì)胞的染色體發(fā)生斷裂后，細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂時(shí)，染色體片段不能隨有絲分裂進(jìn)入子細(xì)胞，而在細(xì)胞漿中形成的圓形或橢圓形微小核［4］，可以推測能進(jìn)入下次分裂周期的細(xì)胞越多，產(chǎn)生微核率和染色體畸變率就越高.反之，細(xì)胞分裂的指數(shù)越低，能觀察到的微核和染色體畸變就越少.這也能解釋在40～100mg／L時(shí)，有絲分裂指數(shù)已低于對照組，微核率和染色體畸變率也出現(xiàn)下降趨勢（仍高于對照組）.但在40～100mg／L時(shí)，有絲分裂指數(shù)有回升趨勢（仍低于對照組），微核率和染色體畸變率還是在下降.可能原因是植物激素在這個(gè)濃度區(qū)間激發(fā)了植物體內(nèi)某些清理機(jī)制，加強(qiáng)了DNA的修復(fù).另外，有絲分裂指數(shù)的回升趨勢并不明顯，可能還達(dá)不到增加微核和染色體畸變的作用.

［1］肖愛國.植物激素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.青海農(nóng)牧業(yè)，2009（1）：41.

［2］曹 佳.微核試驗(yàn)在中國的應(yīng)用、發(fā)展與展望［J］.遺傳，2003，25（1）：73－76

［3］孔志明.環(huán)境毒理學(xué)（第2版）［M］.南京：南京大學(xué)出版社，2004：196－198.

［4］曹 佳，林 真，余爭平.微核試驗(yàn)：原理、方法及其在人群監(jiān)測性評價(jià)中的應(yīng)用［M］.北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2000：1－9.