運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈TGFβ和TNFα表達(dá)的影響

吳曉杰 董聽 汪曉瑞 田振軍

（1.陜西師范大學(xué)體育學(xué)院 西安 710062）

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈TGFβ和TNFα表達(dá)的影響

吳曉杰1董聽1汪曉瑞1田振軍1

（1.陜西師范大學(xué)體育學(xué)院 西安 710062）

目的：探討不同強(qiáng)度訓(xùn)練對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈TGFβ和TNFα表達(dá)的影響。方法：采用跑臺(tái)訓(xùn)練方式建立大鼠有氧運(yùn)動(dòng)和疲勞運(yùn)動(dòng)模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)SABC法研究不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈TGFβ和TNFα表達(dá)的影響。結(jié)果：有氧運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組比較，冠狀動(dòng)脈TGFβ的MOD值雖有降低但并不顯著，TNFα的MOD值明顯降低(P＜0.05)，疲勞運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組和有氧運(yùn)動(dòng)組比較，冠狀動(dòng)脈TGFβ和TNFα表達(dá)有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)論：有氧訓(xùn)練可使TGFβ和TNFα 適度表達(dá),疲勞訓(xùn)練會(huì)導(dǎo)致大鼠冠狀動(dòng)脈TGFβ和TNFα過量表達(dá)。因此認(rèn)為運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與TGFβ和TNFα表達(dá)變化關(guān)系密切。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；冠狀動(dòng)脈；大鼠；TGFβ；TNFα ；免疫組織化學(xué)

冠狀動(dòng)脈心臟?。╟oronary heart disease,CHD）簡(jiǎn)稱冠心病，是嚴(yán)重威脅人民健康的常見病。冠心病尤其是急性心肌梗死(AMI)的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGFβ）屬于多肽生長(zhǎng)因子，是具有多種生物功能的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化、組織修復(fù)、參與炎癥和免疫等作用。有研究報(bào)道，TGFβ可能作為保護(hù)因子參與了CHD的病理過程[1]。腫瘤壞死因子TNFα(tumor necrosis factor alpha)也是一種多功能細(xì)胞因子，主要功能是激活其他細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、壞死或凋亡，抗癌比活性高，能選擇性地使腫瘤發(fā)生出血壞死，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響。它對(duì)廣范圍的腫瘤有細(xì)胞毒副作用，且無(wú)種數(shù)特異性。研究表明，CHD伴代謝綜合癥（MS）患者TNFα水平明顯高于CHD不伴MS患者[2]。其主要機(jī)制可能為TNFα抑制胰島素受體的自身磷酸化，影響肌細(xì)胞及脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)、蛋白合成及向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)位，高濃度時(shí)可減少胰島素受體的數(shù)目，使低密度脂蛋白( LDL)及血糖水平升高，高密度脂蛋白(HDL )水平降低，從而損傷血管內(nèi)膜細(xì)胞，促進(jìn)脂質(zhì)穿透血管膜，導(dǎo)致凝血纖溶系統(tǒng)紊亂和血栓形成，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化[3]。目前，有關(guān)病理?xiàng)l件下冠狀動(dòng)脈結(jié)構(gòu)與功能變化及其機(jī)制研究報(bào)道較多[4-5]。但是對(duì)于生活方式干預(yù)包括運(yùn)動(dòng)鍛煉的強(qiáng)度及其重塑冠狀動(dòng)脈結(jié)構(gòu)與功能的機(jī)制研究報(bào)道尚少見。本文主要研究不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，大鼠冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的TGFβ和TNFα表達(dá)效果的差異，對(duì)冠狀動(dòng)脈疾病的預(yù)防和治療有重要的臨床和生物學(xué)意義。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方法 雄性SD大鼠24只（由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物管理中心提供），3月齡，體重223.4±3.2g，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食，室溫17℃-25℃，濕度45-60%。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、有氧訓(xùn)練組和大強(qiáng)度疲勞組。有氧訓(xùn)練組和大強(qiáng)度疲勞組采用遞增負(fù)荷方式進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷參照Bedford的研究進(jìn)行。對(duì)照組正常籠內(nèi)喂養(yǎng)不運(yùn)動(dòng)。有氧訓(xùn)練組為5d/wk，共8wk。起始速度為15 m/min，時(shí)間為20 min。遞增速度3 m/min，時(shí)間5 min，運(yùn)動(dòng)至速度為20 m/min后，增加跑臺(tái)坡度5%，時(shí)間為60 min。疲勞訓(xùn)練組為6d/wk，共8wk。遞增速度3 m/min，時(shí)間5min，運(yùn)動(dòng)至速度為35 m/min后，增加跑臺(tái)坡度10%，時(shí)間為60 min。

1.2 取材與樣本制備 20%烏拉坦腹腔麻醉，迅速開胸摘取心臟，中性甲醛固定，石蠟包埋、切片（厚5 μm）常規(guī)脫蠟至水。

1.3 免疫組化染色 采用SABC法，按試劑盒（博士德）說明書操作步驟進(jìn)行。切片用去離子水沖洗，3%H2O2封閉，經(jīng)微波抗原修復(fù)15 min，PBS沖洗加生物素封閉液A 10 min滴加正常非免疫血清滴加一抗（TGFβ 和TNFα均為1：75兔抗小鼠、大鼠、人多克隆抗體博士德）4℃過夜復(fù)溫，PBS沖洗滴加二抗PBS沖洗滴加SABCTween、PBS液沖洗，2hDAB顯色脫水透明封片。每次染色設(shè)陰性對(duì)照染色PBS取代一抗。

1.4 數(shù)據(jù)采集與分析

免疫組織化學(xué)觀察采用OLMPUS數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定冠狀動(dòng)脈的平均光密度值（MOD），結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)(± SD)差表示, 由SPSS軟件包處理采用雙因素析因方差分析P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠冠狀動(dòng)脈 TGFβ表達(dá)的平均光密度值比較 光鏡下觀察到冠狀動(dòng)脈VEC和VSMC胞漿陽(yáng)性顆粒呈棕色或棕黃色。表1結(jié)果顯示，與安靜對(duì)照組比較，有氧運(yùn)動(dòng)組的TGFβ的MOD值有所降低而疲勞運(yùn)動(dòng)組的TGFβ的MOD值顯著性升高；與有氧運(yùn)動(dòng)組比較，疲勞運(yùn)動(dòng)組的TGFβ的MOD值顯著性升高。

表1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠冠狀動(dòng)脈TGFβ的MOD值變化比較

2.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠冠狀動(dòng)脈 TNFα表達(dá)的平均光密度值比較 光鏡下觀察到冠狀動(dòng)脈VEC和VSMC胞漿陽(yáng)性顆粒呈棕色或棕黃色。表2結(jié)果顯示，與安靜對(duì)照組比較，有氧運(yùn)動(dòng)組的TNFα的MOD值有所降低而疲勞運(yùn)動(dòng)組的TNFα的MOD值顯著性升高；與有氧運(yùn)動(dòng)組比較，疲勞運(yùn)動(dòng)組的TNFα的MOD值顯著性升高。

表2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠冠狀動(dòng)脈TNFα的MOD值變化比較

3 分析與討論

3.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練引起冠狀動(dòng)脈TGFβ表達(dá)變化的生物學(xué)意義

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFβ廣泛存在于動(dòng)物正常組織細(xì)胞以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，是一族功能廣泛的超家族多肽，是具有多種生物效應(yīng)的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子。在哺乳動(dòng)物中的TGFβ有3種，分別為TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3。其中TGF-β1在體細(xì)胞中所占比例最高（90%），活性最強(qiáng)[6]。TGF-β1對(duì)心血管系統(tǒng)而言是重要的異構(gòu)體，多在內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和造血細(xì)胞中表達(dá)[7]。在血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）、內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）和纖維母細(xì)胞中，低濃度TGF-β1增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成。蔡旭[8]等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死早期血TGF-β1確有升高。但隨損傷心肌和內(nèi)皮細(xì)胞的恢復(fù)，TGF-β1逐漸下降，血液TGF-β1最高是在心肌梗死初期，內(nèi)皮和心肌損傷最重時(shí)，隨著心肌梗塞的恢復(fù)，血清TGF-β1的水平呈下降趨勢(shì)，證明 TGF-β1 是心肌梗死過程的保護(hù)性因素。也有研究報(bào)道[9]TGFβ1的高表達(dá)是心肌纖維化發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子，而心肌纖維化是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同改變。本文研究發(fā)現(xiàn)，有氧訓(xùn)練后大鼠冠狀動(dòng)脈TGFβ的表達(dá)有所減弱。研究提示，有氧訓(xùn)練使血管活性增強(qiáng)，抑制了TGFβ調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化，可能是運(yùn)動(dòng)抵抗多種心血管疾病尤其是冠心病的機(jī)制之一。

TGFβ的適量表達(dá)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有益的影響，但TGFβ的高表達(dá)不僅會(huì)引起強(qiáng)烈的血管舒張導(dǎo)致血壓降低、抑制心臟功能，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用損傷機(jī)體組織。Michael 等[10]觀察到，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者體內(nèi)有活性的TGFβ水平降低，且與粥樣硬化程度呈負(fù)相關(guān)，但外周動(dòng)脈粥樣硬化患者體內(nèi)總TGFβ水平升高。已有研究表明TGFβ的高表達(dá)率是癌癥的惡性表型之一。姚俊等通過實(shí)驗(yàn)證明，過度訓(xùn)練導(dǎo)致腎組織TGFβ表達(dá)的顯著增加，是過度訓(xùn)練造成腎臟組織超微結(jié)構(gòu)及功能損害的重要因素[11]。本文實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，疲勞訓(xùn)練組大鼠冠狀動(dòng)脈TGFβ的MOD值與對(duì)照組和有氧訓(xùn)練組比較均有顯著性增加。推測(cè)疲勞訓(xùn)練可誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈VEC產(chǎn)生過量的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，引起VEC的損傷和VSMC的增殖，可能是疲勞訓(xùn)練引起心血管功能降低的生物學(xué)因素之一。

3.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練引起冠狀動(dòng)脈TNFα表達(dá)變化的生物學(xué)意義

TNFα是一種重要的炎癥細(xì)胞因子，出現(xiàn)在炎癥反應(yīng)早期，可調(diào)節(jié)脂類的代謝從而影響內(nèi)皮功能和血管重建，與動(dòng)脈硬化發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，TNFα不僅來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、以及平滑肌細(xì)胞等也可釋放TNFα[12]。TNFα作為一種主要的致炎因子，它促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒及氧化代謝，加速脂質(zhì)過氧化，使氧化低密度脂蛋白生成增多，破壞內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完整性，使內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管活性物質(zhì)平衡失衡，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[13]。Krown等[14]利用單核細(xì)胞核微凝膠電泳法(彗星分析)檢測(cè)凋亡細(xì)胞，探討TNFa與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TNFa使培養(yǎng)鼠心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，且凋亡細(xì)胞數(shù)量與TNFa濃度呈正比。并且認(rèn)為TNFa可以通過刺激心肌組織合成、釋放NO，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的原癌基因表達(dá)的增強(qiáng)，以及促進(jìn)凋亡基因FasmRNA的表達(dá)增強(qiáng)等途徑來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的。目前多數(shù)研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可以降低TNFa的水平。但有關(guān)有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)冠狀動(dòng)脈TNFα的影響未見報(bào)道。Monzillo 等[15]發(fā)現(xiàn)，肥胖受試者進(jìn)行6個(gè)月的中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，血清TNFα呈下降趨勢(shì)。毛麗娟等[16]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過十周的遞增負(fù)荷訓(xùn)練后，大鼠血清TNFa的含量與安靜對(duì)照組相比有所下降。本文研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過8周有氧訓(xùn)練的大鼠冠狀動(dòng)脈TNFα與對(duì)照組比較表達(dá)有所下降，進(jìn)一步說明了適當(dāng)?shù)挠醒踹\(yùn)動(dòng)可以使TNFα的含量下降，其機(jī)制可能與TNFα的變化與細(xì)胞凋亡的易感性有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在適量運(yùn)動(dòng)的情況下，冠狀動(dòng)脈中細(xì)胞凋亡受到抑制，正常細(xì)胞的生存占優(yōu)勢(shì)地位，可能是增強(qiáng)冠狀動(dòng)脈功能，預(yù)防冠狀動(dòng)脈疾病的機(jī)制之一。

目前多數(shù)研究表明TNFα在多種病理狀態(tài)下表達(dá)升高。資料顯示，冠狀動(dòng)脈狹窄患者的血液TNFα的含量明顯高于健康對(duì)照組，且TNFα的含量與粥樣硬化斑塊的程度有關(guān)，即病變?cè)絿?yán)重，TNFα生產(chǎn)量就越多[17]。TNFα在心衰患者血清中也有較高的水平。長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可引起血漿TNFα的升高。1993年Tilz報(bào)道長(zhǎng)時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)的18位受試者血漿中TNFα受體含量明顯增加[18]。Kimura[19]研究發(fā)現(xiàn)，男性青年進(jìn)行30min恒定負(fù)荷功率車運(yùn)動(dòng)中，50%VO2max 強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)未引起血漿TNFα變化，但80%VO2max 強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)使血漿TNFα顯著升高。本文研究顯示經(jīng)過8周疲勞訓(xùn)練的大鼠冠狀動(dòng)脈與對(duì)照組和有氧訓(xùn)練組比較，TNFα的表達(dá)顯著性升高。進(jìn)一步說明了長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可以誘導(dǎo)TNFα表達(dá)增加。而TNFα濃度的高低與細(xì)胞凋亡直接相關(guān)[14]。因此推測(cè)出機(jī)體在進(jìn)行大強(qiáng)度疲勞性運(yùn)動(dòng)后，冠狀動(dòng)脈VSMC和VEC可能出現(xiàn)凋亡。這可能是大強(qiáng)度疲勞性運(yùn)動(dòng)后引起心血管機(jī)能發(fā)生改變的原因之一。

4 結(jié)論

長(zhǎng)期有氧訓(xùn)練可使冠狀動(dòng)脈TGFβ和TNFα適度表達(dá)；而長(zhǎng)時(shí)間疲勞訓(xùn)練會(huì)導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈 TGFβ和TNFα表達(dá)大幅度上升，是大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練引起冠狀動(dòng)脈產(chǎn)生機(jī)體組織異常的重要生物學(xué)因素。

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Effects of Exercises Training Intensity on Expression of TGFβ and TNFα in the Rats Coronary

WU Xiaojie , etal.
(Department of Physical EducationShaanxi Normal University, Xi`an, Shaanxi, 710062)

Objective： To discuss the effect of different exercise intensity on expression of TGFβ and TNFα in the rat coronary. Method Use treadmill exercise to establish the models of aerobic exercised dandy fatigue exercise rats. We utilize immunohisto- chemistry of SABC to measure different exercise intensity to rat coronary TGFβ and TNFα expression. Result： Comparing between aerobic training group and control group, the MOD of TGFβ in coronary expression decreased but has no difference in three groups. The MOD of TNFα expression was significant. The fatigue group coronary TGFβ and TNFα expression compare with the control group and aerobic group were significant. Conclusion： Expression change of rats coronary TGFβ and TNFα was caused by exercise training also had a closed relation with the exercise intensity. Moderate expression of coronary TGFβ and TNFα could be caused by aerobic exercise, and the fatigue training could cause the rats coronary TGFβ and TNFα excessive expression. Therefore we believed that the exercise training causes the TGFβ and TNFα expression change.

exercise training；coronary；rat；TGFβ；TNFα；immunohistochemisty

吳曉杰（1985—），男，山西臨汾人，在讀碩士，研究方向：運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)。