生物芯片技術(shù)及其在食品營養(yǎng)與安全檢測中的應(yīng)用

唐亞麗盧立新趙 偉

（1.江南大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院包裝工程系，江蘇 無錫 214122；2.中國包裝總公司食品包裝技術(shù)與安全重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

生物芯片技術(shù)及其在食品營養(yǎng)與安全檢測中的應(yīng)用

唐亞麗1，2盧立新1，2趙 偉3

（1.江南大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院包裝工程系，江蘇 無錫 214122；2.中國包裝總公司食品包裝技術(shù)與安全重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

從食品營養(yǎng)與安全角度出發(fā)，介紹生物芯片的原理及分類，著重討論此類技術(shù)在食源性微生物檢測、有害物質(zhì)分析及食品營養(yǎng)與疾病機(jī)理方面的研究，旨在為食品工業(yè)與高新檢測技術(shù)的進(jìn)一步結(jié)合提供理論幫助。

生物芯片；營養(yǎng)；食品安全

生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代初期發(fā)展起來的一門新興技術(shù)。通過微加工技術(shù)制作的生物芯片，可以把成千上萬乃至幾十萬個生命信息集成在一個很小的芯片上，達(dá)到對基因、抗原和活體細(xì)胞等進(jìn)行分析和檢測的目的。用這些生物芯片制作的各種生化分析儀和傳統(tǒng)儀器相比較具有體積小、重量輕、便于攜帶、無污染、分析過程自動化、分析速度快、所需樣品和試劑少等優(yōu)點。因此，生物芯片技術(shù)得到各國學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的關(guān)注，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)食品等領(lǐng)域。

1 生物芯片的原理及分類

1.1 生物芯片的原理

生物芯片的實質(zhì)是通過微加工技術(shù)在面積不大的基片表面上有序的點陣排列一系列固定于一定位置的可尋址的識別分子。結(jié)合或反應(yīng)在相同條件下進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)果用同位素法、化學(xué)發(fā)光法或酶標(biāo)法顯示，然后用精密的掃描儀或CCD攝像技術(shù)紀(jì)錄。通過計算機(jī)軟件分析，綜合成可讀的IC總信息（圖1）。

圖1 生物芯片分析步驟Figure 1 The analytical procedure of biochips

1.2 生物芯片的分類

生物芯片技術(shù)主要包括微流路芯片、陣列生物芯片和微縮芯片實驗室三大類。此外，根據(jù)芯片上的探針又可分為以下幾類：基因芯片（gene chip）、組織芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片。

1.2.1 微流路芯片 IC生物芯片是基于CMOS而設(shè)計的。其檢測元件由光電晶體管和光電二極管以4×4或是10×10陣列組成。微流路生物芯片是在IC芯片的基礎(chǔ)上以光刻或化學(xué)濕腐蝕技術(shù)制備的［1］。微流路芯片的微縮使毛細(xì)管電泳進(jìn)樣、分離和檢測的集成成為可能，分析速度大大提高，樣品與溶劑的消耗大大減少，檢測效率也得以提高。

1.2.2 陣列生物芯片 陣列生物芯片主要是基于雜交測序法（sequencing by hybridization，SBH）技術(shù)的檢測方法。將一組掛核苷酸探針固定在硅、玻璃等基片表面，組成一個二維陣列。在這個陣列上每一個探針都有其特定的坐標(biāo)位置，只要合理地設(shè)計陣列，與待測的DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)，利用雜沖洗去非特異性的DNA，然后檢測雜交信號，再通過一定的算法就可以得到待測的DNA序列［2］。

1.2.3 縮微芯片實驗室 縮微芯片實驗室是集樣品制備、基因擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測為一體，實現(xiàn)生化分析全過程，是生物芯片發(fā)展的最高階段［3］。

1.2.4 基因芯片 基因芯片又稱 DNA微陣列（DNA microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列形成的探針陣列。基因芯片把大量已知序列探針集成在同一基片上，經(jīng)過標(biāo)記的若干靶核苷酸序列通過與芯片特定位置上的探針雜交，便可根據(jù)堿基互補匹配原理確定靶基因的序列。通過處理和分析基因芯片雜交檢測圖像，可以對生物細(xì)胞或組織中的大量基因信息進(jìn)行分析。Hardy等［4］利用基因芯片技術(shù)對缺失型DMD患者進(jìn)行了檢測。將基因芯片技術(shù)與傳統(tǒng)PCR技術(shù)作對照，顯示出明顯的靈敏、高效等優(yōu)勢。

1.2.5 組織芯片 生物芯片技術(shù)在病理組織和組織化學(xué)方面的應(yīng)用，可以用組織芯片的出現(xiàn)作為代表。組織芯片是利用各種酶、核素或熒光標(biāo)記的不同基因、寡核苷酸、抗體在微縮組織切片上進(jìn)行雜交和標(biāo)記染色，最后在顯微鏡下獲取圖像信息（或通過計算機(jī)處理所獲的信息），以研究目的基因或基因產(chǎn)物在不同組織之間的表達(dá)差異。主要用于蛋白表達(dá)研究、抗體篩選、組織型特異性研究及小鼠模式試驗；組織化學(xué)試劑盒用于組織芯片的染色。

1.2.6 蛋白質(zhì)芯片 蛋白質(zhì)芯片是利用抗體與抗原結(jié)合的特異性，以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的檢測。蛋白質(zhì)芯片主要應(yīng)用于結(jié)合分析，激酶分析、蛋白酶分析、細(xì)胞分析。用于發(fā)展新的活性肽，肽的優(yōu)化及轉(zhuǎn)化，并以此來尋找新藥的先導(dǎo)化合物。

1.2.7 細(xì)胞芯片 細(xì)胞芯片比蛋白質(zhì)芯片的優(yōu)越之處，在于此法不需要蛋白純化，細(xì)胞是研究膜結(jié)合蛋白更好的對象。CDNA比蛋白更穩(wěn)定，并可監(jiān)測表達(dá)時間短暫的蛋白。

2 生物芯片技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

2.1 食源性微生物的監(jiān)測

與傳統(tǒng)檢測方法及分子生物學(xué)、免疫學(xué)方法相比，生物芯片技術(shù)特異性強，準(zhǔn)確率高?？蓱?yīng)用于食物中致病菌的快速診斷、轉(zhuǎn)基因食品分析等，具有廣闊的應(yīng)用前景和較大的經(jīng)濟(jì)與社會效益［5］。

2.1.1 單種微生物的分析鑒定

（1）大腸桿菌：大腸桿菌是人類和大多數(shù)溫血動物腸道中的正常菌群，但也有某些血清型的大腸桿菌可引起不同癥狀的腹瀉。致病性大腸桿菌通過污染飲水、食品、娛樂水體引起流行疾病暴發(fā)，病情嚴(yán)重者，可危急生命。Bruant等［5］設(shè)計了E.coli189個毒力基因和30個耐藥性基因的寡核苷酸基因芯片用于E.coli致病性及其耐藥性的監(jiān)測，為E.coli的環(huán)境檢測、流行病學(xué)和遺傳變異研究提供了強有力的工具。Chandler等［6］確定免疫磁珠分離結(jié)合微陣列可檢測生禽肉清洗液中的O157∶H7，其檢測限達(dá)103CFU/mL。

（2）金黃色葡萄球菌：金黃色葡萄球菌在自然界中分布廣泛，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個細(xì)菌性食物中毒的33%。Sergeev等［7］利用基因芯片同時檢測和鑒定了多個腸毒素基因，在同一個金黃色葡萄球菌菌株中最多檢測到9個不同的腸毒素基因。高志賢等［8］用玻片表面分別固定兔抗SEA、SEB、SEC 3種抗體，檢測葡萄球菌腸毒素（SE），檢測的靈敏度為納克每毫升（ng/mL）水平。李玉鋒等［9］采用PCR方法擴(kuò)增金黃色葡萄球菌16Sr－RNA基因的DNA片段，建立了快速鑒定食源性金黃色葡萄球菌的基因芯片技術(shù)。

（3）李斯特氏菌：李斯特氏菌4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒嚴(yán)重的可引起血液和腦組織感染。Volokhov等［10］通過單管復(fù)合體擴(kuò)增和基因芯片技術(shù)簡便、迅速地鑒別李斯特菌屬6個種的基因型。Borucki等［11］構(gòu)建的混合基因組微陣列可準(zhǔn)確鑒別各種近緣單核細(xì)胞增生李斯特菌分離物。

（4）蠟狀芽孢桿菌：蠟狀芽孢桿菌細(xì)菌對外界有害因子抵抗力強，分布廣，是典型的菌體細(xì)胞，可產(chǎn)生腸毒素，包括腹瀉毒素和嘔吐毒素。幾乎所有的蠟狀芽胞桿菌均可在多種食品中產(chǎn)生腹瀉毒素。在土壤、灰塵、腐草、空氣中都有此菌存在。肉類制品、奶類制品、蔬菜和水果的帶菌率為20%～70%。Gabig－Ciminska等［12］采用基因芯片檢測方法，4h內(nèi)即可檢出細(xì)菌細(xì)胞或芽孢的DNA信號。

（5）弧菌：危害中國海水養(yǎng)殖魚類的主要病原是弧菌。Panicker等［13］利用多重PCR與特異基因DNA芯片耦合的方法，對海水和貝類樣品的致病性弧菌（創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌）進(jìn)行了檢測，該方法的特異性為100%?？梢员ＷC快速、準(zhǔn)確地檢測貝類食品的致病性弧菌。金慧英等［14］選擇霍亂弧菌特異的編碼外膜蛋白的ompW基因和毒素ctxA基因，設(shè)計引物和探針，并制備檢測芯片，通過2次PCR擴(kuò)增，制備熒光標(biāo)記的靶序列，并與芯片進(jìn)行雜交，研制了一種快速、特異、靈敏的檢測霍亂弧菌基因芯片。

2.1.2 多種微生物的分析鑒定 利用生物芯片技術(shù)不僅可以分析單一微生物，還可以對多種微生物進(jìn)行鑒定。Wilson等［15］開發(fā)出一套多病原體識別（MPID）微陣列，可準(zhǔn)確識別18種致病性病毒、原核生物和真核生物，對炭疽桿菌的檢測限低至10fg（×10－15）。陳廣全等［16］研制了一種高通量檢測食品中常見致病微生物的寡核普酸微陣列芯片，可鑒別金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157∶H7、霍亂弧菌、空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、乙型溶血型鏈球菌和副溶血性弧菌。特異性良好，無交叉反應(yīng)。Carl等［17］對4種細(xì)菌，即大腸埃希菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、空腸彎曲菌采用了基因芯片的檢測方法，其檢測結(jié)果不僅敏感度高于傳統(tǒng)方法，且操作簡單，重復(fù)性好，并節(jié)省了大量時間，大大提高了4種細(xì)菌診斷效率。Hong等［18］設(shè)計了基于23SrRNA的寡核苷酸芯片，可同時檢測食品中的14種致病菌。陳昱等［19］建立一種運用多重PCR和基因芯片技術(shù)檢測和鑒定志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157的方法。趙金毅等［20］利用可視芯片技術(shù)可以準(zhǔn)確的檢出沙門氏菌屬和金黃色葡萄球、小腸結(jié)核腸炎耶爾森氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌3種食品中常見致病菌。

2.2 食源性病毒的檢測

在動物疫病病原菌的檢測方面，已開發(fā)了分別用于馬毒性動脈炎病毒（EAV）、非洲馬瘟病毒（AHS）、馬鼻肺炎病毒（EHV－4）、馬冠狀病毒（ECV）和西尼羅熱病毒（WNV）5種馬病毒檢測和犬病病毒檢測的基因芯片?？蓪⒒蛐酒夹g(shù)用于食源性致病病毒諾如病毒、輪狀病毒、甲肝病毒、星狀病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測。

陳廣全等［21］采用基因芯片方法檢測貝類食品中引起人類腹瀉的5種食源性致病病毒。該基因芯片具有良好的特異性，在5種病毒之間無交叉反應(yīng)，其靈敏度與熒光PCR方法基本一致。楊素等［22］設(shè)計的針對于口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、藍(lán)舌病病毒、鹿流行性出血熱病毒和赤羽病病毒的基因芯片，可同時診斷上述5種動物傳染病。周琦等［23］也研制出用于檢測SARS病毒的全基因芯片，可對病人、出入境食品、動植物及其產(chǎn)品進(jìn)行檢測。

2.3 藥物殘留的分析

藥物殘留可以隨著食物鏈進(jìn)入人體，對人類的健康構(gòu)成潛在的威脅。目前，多種藥物殘留可以通過生物芯片技術(shù)進(jìn)行檢測，主要包括：磺胺二甲基嘧啶、鏈霉素、恩諾沙星和克倫特羅，檢測對象包括了雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、豬尿和牛奶等。具有前處理簡單，靈敏度高，特異性好，檢測速度快，檢測通量高，質(zhì)控體系嚴(yán)密等優(yōu)點。

張東等［24］采用微珠芯片免疫分析法，實現(xiàn)了對動物源性食品中氯霉素殘留有效、快速的檢測。方法檢測限為0.01μg/L，具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，符合快速、高通量檢測氯霉素殘留的要求，并為實現(xiàn)介觀流控免疫分析提供了基礎(chǔ)。Knecht等［25］采用間接競爭ELISA模式，建立一種可快速、自動、平行檢測牛奶中10種抗生素殘留的蛋白質(zhì)微陣列，單個組分檢測所用時間不到5min，10種組分的檢測限在0.12～32μg/L之間。Zuo等［26］構(gòu)建了一種可同時檢測食品中3種獸藥殘留的小分子微陣列（small molecule microarrays，SMMs），檢測時間不超過2h，待測樣品檢測與加標(biāo)回收試驗結(jié)果表明所構(gòu)建的微陣列具有良好的可靠性。Belleville等［27］應(yīng)用芯片技術(shù)監(jiān)測小分子的農(nóng)藥敵草腈的代謝物2，6－二氯苯甲酰胺和阿特拉津，其最低檢測限分別為1ng/L和3ng/L，試驗結(jié)果明顯優(yōu)于ELISA和GC/MS檢測方法。郭志紅等［28］對豬和雞組織樣品中獸藥殘留等進(jìn)行檢測，能夠同時檢測各種殘留，結(jié)果與使用ELISA試劑盒、HPLC法及GC－MS法得到的結(jié)果有很好的一致性。左鵬等［29］利用蛋白芯片競爭法快速準(zhǔn)確測定動物源性食品中氯霉素、磺胺二甲嘧啶的殘留量，該方法具有快速、高通量、并行性等特點，尤其適合出入境檢驗檢疫、食品安全監(jiān)管、品質(zhì)控制等領(lǐng)域作為初篩方法應(yīng)用。

2.4 真菌毒素的檢測

真菌毒素是真菌在食品或飼料里生長所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對人類和動物都有害。Tudos等［30］將酪蛋白與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）共軛連接制成人工抗原，固定在芯片上，再加入含有DON抗體的待檢測溶液，通過SPR技術(shù)檢測反應(yīng)信號，從而構(gòu)建了一種用于對小麥中DON進(jìn)行定量分析的免疫芯片。該芯片用鹽酸胍處理可反復(fù)使用500次，最佳檢測范圍為2.5～30ng/mL，檢測結(jié)果與使用氣質(zhì)聯(lián)用（GC－MS）檢測一致。

2.5 轉(zhuǎn)基因食品的檢測

轉(zhuǎn)基因食品（GMF）是指利用基因工程技術(shù)改變基因組成構(gòu)成的動物、植物和微生物生產(chǎn)的食品和食品添加劑。轉(zhuǎn)基因食品代表了當(dāng)今高新農(nóng)業(yè)技術(shù)的發(fā)展方向，有著非常巨大、潛在效益和市場。就目前轉(zhuǎn)基因食品檢測中常用的ELISA和PCR技術(shù)而言，最大的缺點是檢測范圍窄，效率低，無法高通量大規(guī)模地同時檢測多種樣品，尤其是對轉(zhuǎn)基因背景一無所知的情況下，對各種候選待檢基因序列或蛋白的逐一篩查幾乎是不可能的。生物芯片具有高通量、微型化、自動化和信息化的特點，是轉(zhuǎn)基因食品檢測的方向?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于大豆、玉米、油菜、棉花等農(nóng)作物樣品的檢測。

Lok－Ting Lau等［31］應(yīng)用 DNA 芯片及 PCR技術(shù)測定轉(zhuǎn)基因大豆中的重組子DNA，證明重組DNA源于大豆基因組并不會傳入非大豆基因物質(zhì)。許小丹等［32］制備了檢測及鑒定轉(zhuǎn)基因大豆的寡核苷酸芯片。該芯片探針特異性好、靈敏度高，檢測極限為0.1ng（DNA），從而消除假陰性概率，靈敏度優(yōu)于凝膠電泳檢測。

3 生物芯片技術(shù)在食品營養(yǎng)分析中的應(yīng)用

3.1 營養(yǎng)機(jī)理的研究

基因芯片最重要的應(yīng)用是研究代謝與基因調(diào)節(jié)。生理學(xué)的轉(zhuǎn)化常常伴隨組織學(xué)和生物化學(xué)（包括基因表達(dá)方式）的變化，基因活動的上調(diào)或下調(diào)是病理生理學(xué)及疾病的起因。資料［33］表明，某些食品具有疾病預(yù)防與控制功效，但其機(jī)理尚不清楚。生物芯片技術(shù)可用于營養(yǎng)機(jī)理的研究，如營養(yǎng)與腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的研究［34］，營養(yǎng)與心腦血管疾病關(guān)系的分子學(xué)研究［35－36］等。

利用人全部基因的cDNA芯片研究在營養(yǎng)素缺乏、適宜和過剩等狀況下的基因表達(dá)圖譜，結(jié)合基因表達(dá)與蛋白質(zhì)表達(dá)的結(jié)果，將為確認(rèn)人體對營養(yǎng)素準(zhǔn)確需要量的生物標(biāo)志物奠定堅實的基礎(chǔ)，并為制定更準(zhǔn)確、合理的膳食參考攝入量（DRIs）提供依據(jù)。Lyakhovich等［37］應(yīng)用DNA芯片技術(shù)首次揭示了維生素D可能通過調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的FGF27的表達(dá)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長分化。芯片技術(shù)可用于單核苷酸多態(tài)性（SNPs）檢測，以研究人體對于營養(yǎng)素需求的個體差異［38］。

3.2 營養(yǎng)成分的分析與生物活性物質(zhì)的檢測

傳統(tǒng)的檢測方法對食品的營養(yǎng)成分及活性物質(zhì)檢測是非常繁瑣的，而應(yīng)用生物芯片技術(shù)則可以快速準(zhǔn)確的分析食品的營養(yǎng)成分與活性物質(zhì)，對食品的類別和性質(zhì)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定。

法國Biomerieux公司建立的食品營養(yǎng)分析芯片——“食品專家－ID”可以用于動物食品的品質(zhì)鑒定，以確認(rèn)該食品是否貨真價實。Li等［39］設(shè)計了一種有多個分支的微流路芯片，用于快速分離分析蛋白消解產(chǎn)物，并用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（CE－Chip－MS/MS）進(jìn)行多肽測序和蛋白定性。Marquette［40］用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)改進(jìn)生物芯片，將乳酸鹽氧化酶、膽堿氧化酶、葡萄糖氧化酶及發(fā)光氨結(jié)合到基片上，以測定葡萄糖、乳酸鹽及膽堿。Barella等［41］應(yīng)用DNA芯片測定大鼠肝臟中VE敏感基因，并由此探索α－生育酚在肝臟代謝中的重要作用。Hadd等［42］在多分支的微流路芯片上用乙酰膽堿酯酶測定乙酰膽堿酯酶抑制劑的含量。乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿水解生成膽堿，膽堿與熒光劑（香豆素苯基馬來酰亞胺）在線反應(yīng)產(chǎn)生熒光標(biāo)記膽堿，用LIF檢測。酶抑制劑可降低熒光強度，產(chǎn)生一個負(fù)峰，從而達(dá)到檢測乙酰膽堿酯酶抑制劑的目的。

4 結(jié)語

食品成分分析、新產(chǎn)品開發(fā)、食品安全全程控制體系等方面對食品分子檢驗手段提出更多、更高的要求。生物芯片技術(shù)因其可在一次反應(yīng)中進(jìn)行多種信息的平行分析，而受到研究者的矚目，特別是基因芯片在人類基因組計劃研究中的應(yīng)用，不僅極大地促進(jìn)了該項工作的進(jìn)行，也使芯片技術(shù)在短短的幾年間得到了長足的發(fā)展，并迅速在食品科學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。隨著生物芯片技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，食品科學(xué)研究的逐步深入，生物芯片將會作為一種簡便快捷的技術(shù)，為食品工業(yè)的發(fā)展帶來極大的便利。

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Application of biochip on food nutrition and safety

TANG Ya－li1，2LU Li－xin1，2ZHAO Wei3

（1.Department of Packaging Engineering，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu214122，China；2.The Key Laboratory of Food Packaging Techniques and Safety of China National Packaging Corporation，Wuxi，Jiangsu214122，China；3.State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu214122，China）

The application of biochip in food nutrition and safety，especially the detection of food borne pathegon，analysis of harmful substences and researches on food nutrition，together with the prospect of biochip technique in food industry，were discussed.

biochip；nutrition；food safety

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.047

唐亞麗（1982－），女，江南大學(xué)副教授，博士。E－mail：tyl＠jiangnan.edu.cn

2010－06－01