布氏乳桿菌產(chǎn)生甘露醇的發(fā)酵研究

侯建革,王 芳,王麗麗,趙長新

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,遼寧大連 116034;2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050018)

布氏乳桿菌產(chǎn)生甘露醇的發(fā)酵研究

侯建革1,2,王 芳2,王麗麗2,趙長新1

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,遼寧大連 116034;2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050018)

實(shí)驗(yàn)研究布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)CICC 6007發(fā)酵產(chǎn)生甘露醇。結(jié)果表明,在厭氧培養(yǎng)條件下,甘露醇的積累量與菌體生長量呈正相關(guān)性。在種子培養(yǎng)36 h,接種量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為20%,p H值為6.5,溫度為35℃,培養(yǎng)基總糖為150 g/L,其中果糖與葡萄糖的大約消耗比值為3∶1(質(zhì)量比),培養(yǎng)48 h,甘露醇產(chǎn)量可達(dá)68.5 g/L,甘露醇對(duì)果糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到78.7%,為發(fā)酵法生產(chǎn)甘露醇奠定了基礎(chǔ)。

甘露醇;發(fā)酵;布氏乳桿菌

甘露醇(mannitol),又稱D-甘露糖醇,分子式為C6H14O6,熔點(diǎn)為166℃。甘露醇在自然界生物體內(nèi)廣泛存在,具有多種功能,被廣泛用于食品、醫(yī)藥、輕工和化工等領(lǐng)域[1]。由于甘露醇在人體內(nèi)代謝與體內(nèi)胰島素?zé)o關(guān),可以作為低熱值食品和低糖食品的甜味劑,適用于糖尿病患者、肝功能障礙者。甘露醇的主要生產(chǎn)工藝有天然提取法和化學(xué)催化法,自然界中還發(fā)現(xiàn)很多微生物菌株可以合成甘露醇。已經(jīng)報(bào)道的微生物類群有霉菌、酵母菌和細(xì)菌[2-6],但沒有工業(yè)化生產(chǎn)報(bào)道。

YUN等研究了不同碳源對(duì)2株乳酸菌產(chǎn)甘露醇的影響,發(fā)現(xiàn)以果糖或蔗糖為碳源時(shí)甘露醇的積累量顯著[7]。W EYM ARN等對(duì)乳酸菌發(fā)酵甘露醇的條件進(jìn)行優(yōu)化,甘露醇最大容積產(chǎn)率達(dá)到16 g/(L·h),腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)A TCC-9135產(chǎn)甘露醇的容積產(chǎn)率達(dá)到20 g/(L·h),轉(zhuǎn)化率達(dá)97%[8]。本研究采用布氏乳桿菌為實(shí)驗(yàn)菌株,初步探索其甘露醇的發(fā)酵條件。

1 材料和方法

1.1 材 料

菌種:布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)CICC 6007。

種子培養(yǎng)基(1 L):10 g蛋白胨;10 g牛肉膏;10 g酵母膏;2 g檸檬酸二銨;2 g乙酸鈉;2 g磷酸氫二鉀;20 g葡萄糖;50 mg M gSO4;50 mg M nSO4;50 mg ZnSO4;1 mL吐溫80;p H值為6.3。

發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L):5 g蛋白胨;5 g牛肉膏;5 g酵母膏;2 g檸檬酸二銨;2 g乙酸鈉;2 g磷酸氫二鉀;20 g葡萄糖;40 g果糖;50 mg M gSO4;50 mg M nSO4;50 mg ZnSO4;1 mL吐溫80;1 m L復(fù)合B族維生素;p H值為6.3。

固體培養(yǎng)基:含2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂的種子培養(yǎng)基。

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的半胱氨酸鹽酸鹽溶液:半胱氨酸鹽酸鹽0.75 g,用蒸餾水定容至50 m L。

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%的咔唑酒精溶液:咔唑60.0 mg,用酒精定容至50 mL,放置在棕色瓶中,24 h后使用。

硫酸溶液:量取分析純濃硫酸450 m L,在不斷攪拌下徐徐倒入190 m L蒸餾水中。

果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取預(yù)先在55℃真空干燥至恒重的分析純果糖250 mg,用蒸餾水定容至50 m L(5 m g/m L),存放于冰箱中備用,使用時(shí)稀釋100倍(50 m g/L)。

Nash試劑:精確稱取醋酸銨15.00 g,用蒸餾水溶解,加入0.2 m L冰醋酸及0.2 m L乙酞丙酮,定容至100 m L。

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的L-鼠李糖:準(zhǔn)確稱取0.10 gL-鼠李糖溶于蒸餾水中,定容至100 m L。

0.15 mol/L的高碘酸鈉:準(zhǔn)確稱取0.321 g高碘酸鈉,溶于0.12 mol/L的鹽酸溶液中,定容至100 mL。

甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)品甘露醇500 mg,溶于蒸餾水中,定容至50 mL(10 mg/m L),使用時(shí)稀釋100倍(100 mg/L)。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖500 mg,溶于蒸餾水中,定容至50 mL(10 mg/m L),使用時(shí)稀釋100倍(100 mg/L)。

1.2 方 法

1.2.1 發(fā)酵液中果糖檢測方法——咔唑法

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取25 m L比色管,分別加50 m g/L的果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 m L,再用蒸餾水分別補(bǔ)充至1 m L,然后每管中加入0.2 m L半胱氨酸鹽酸鹽溶液及6 m L硫酸溶液,搖勻后,立即加入0.2 mL咔唑酒精溶液,搖勻,于60℃水浴中保溫10 min,取出用水冷卻呈紅紫色,在560 nm波長下比色,以吸光度對(duì)果糖含量(質(zhì)量濃度,下同)作圖,即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定:將發(fā)酵液適當(dāng)稀釋,準(zhǔn)確吸取1.0 mL,使其中果糖質(zhì)量濃度在10～50 mg/L的范圍內(nèi),然后按作果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作進(jìn)行。根據(jù)獲得的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查得相應(yīng)的果糖量。

1.2.2 發(fā)酵液中甘露醇檢測方法——Nash試劑法

發(fā)酵液中甘露醇含量的測定可利用高碘酸鈉氧化甘露醇的產(chǎn)物,與新鮮的Nash試劑作用產(chǎn)生黃色的3,5-二乙酰-1,4脫氫二甲基吡啶的顯色反應(yīng),按照文獻(xiàn)[9]所提供的方法測定發(fā)酵液中甘露醇。

甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取25 mL比色管,分別準(zhǔn)確加入100 mg/L的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1.0 mL,再用蒸餾水分別補(bǔ)充至1 m L,然后在每支比色管中加入1 m L濃度為0.15 mol/L的高碘酸鈉溶液,混勻,放10 min后加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的L-鼠李糖溶液,充分混勻后加入Nash試劑4 mL,于50℃水浴保溫15 min,取出用水冷卻。用10 mm光徑的比色皿,在412 nm波長下測定吸光度,以吸光度對(duì)甘露醇濃度作圖,即得甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定:取樣液2 m L于試管中,加入濃鹽酸3 m L,沸水浴加熱10 min,冷卻,稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度,使甘露醇質(zhì)量濃度低于0.05 m g/m L,然后按作甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作進(jìn)行。根據(jù)獲得的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查得相應(yīng)的甘露醇的質(zhì)量濃度。

葡萄糖的干擾:取25 m L比色管,分別準(zhǔn)確加入100 m g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1,0.5,1.0 m L,再用蒸餾水分別補(bǔ)充至1 mL,按照甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作進(jìn)行,測定吸光度。

果糖的干擾:配制一系列果糖溶液,質(zhì)量濃度分別為0,10,20,30,40,50 g/L,取1 m L按照樣品測定的方法測定吸光度。

1.2.3 發(fā)酵液中葡萄糖檢測方法——葡萄糖試劑盒

葡萄糖試劑盒中配有葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,質(zhì)量濃度為ρ標(biāo)=1 mg/m L。用20μL的移液槍取20μL于7 m L的離心管中,快速加入1.5 m L酶試劑(葡萄糖試劑盒中試劑Ⅰ)和1.5 mL酚試劑(葡萄糖試劑盒中試劑Ⅱ),混合均勻,于37℃保溫20 m in,使用光徑10 mm的比色皿,測定505 nm波長下的吸光度,記錄A標(biāo)。

將樣品稀釋到合適質(zhì)量濃度(葡萄糖質(zhì)量濃度為1 m g/m L左右),操作方法同上,記錄吸光度ρ樣。樣品的質(zhì)量濃度計(jì)算如下:

式中:ρ標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/L);A標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖吸光度;A樣為樣品葡萄糖吸光度;D為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 發(fā)酵過程的p H值控制

在布氏乳桿菌厭氧生長過程當(dāng)中會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸、乙酸和二氧化碳,這些產(chǎn)物使發(fā)酵液的p H值下降從而影響菌體的正常生長,需采用滴加氨水來中和發(fā)酵液中p H值。

1.2.5 菌體濕重的檢測方法

將發(fā)酵液混勻,取5 mL發(fā)酵液于7 mL的離心管中,于9 000 r/min離心10 min,棄去上清液,稱量菌體的質(zhì)量。

1.2.6 培養(yǎng)過程

將活化的布氏乳桿菌接入種子培養(yǎng)基中,30℃厭氧培養(yǎng)3 d,按20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,靜止培養(yǎng),發(fā)酵過程中檢測菌體濕重、產(chǎn)酸量和甘露醇的產(chǎn)生量。

2 結(jié)果與討論

2.1 果糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及其干擾因素(見表1及圖1)

表1 甘露醇、葡萄糖對(duì)果糖檢測方法的干擾Tab.1 Interference of mannitol and glucose on the detection of fructose

由圖1可知,測定果糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性相關(guān)性良好,同時(shí)表1的結(jié)果顯示出甘露醇和葡萄糖對(duì)該方法的影響很小,因此可以作為發(fā)酵液中果糖的檢測方法。

圖1 果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of fructose

2.2 甘露醇測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及干擾(見圖2及表2、表3)

表2 葡萄糖對(duì)甘露醇檢測方法的干擾Tab.2 Interference of glucose on the detection of mannitol

表3 果糖對(duì)甘露醇檢測方法的干擾Tab.3 Interference of fructose on the detection of mannitol

圖2 甘露醇的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of the detection of mannitol

由表2和表3可以看出,葡萄糖和果糖對(duì)測定甘露醇的方法干擾都很小,可以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中甘露醇的檢測。

2.3 布氏乳桿菌CICC 6007的生長曲線

將平板上活化的菌接入種子培養(yǎng)基中,于30℃厭氧靜止培養(yǎng),每12 h取樣測定菌體濕重,用氨水調(diào)節(jié)維持p H值為6.5,測定CICC 6007的生長曲線,見圖3。由圖3可見,12～48 h為對(duì)數(shù)生長期,在36～48 h時(shí)菌體活力非常高,生長到48 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期,因此種子培養(yǎng)時(shí)間確定為36 h。

2.4 甘露醇的發(fā)酵與菌體生長

將培養(yǎng)了36 h的一級(jí)種子,以20%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中,每12 h調(diào)節(jié)p H值為6.5,并取樣測定菌體濕重和甘露醇的產(chǎn)量,參見圖4。

由圖4可以看出,菌體生長與甘露醇積累基本同步,屬于生長偶聯(lián),因此甘露醇屬于初級(jí)代謝產(chǎn)物,發(fā)酵時(shí)間48 h之后,菌體量、甘露醇都趨于穩(wěn)定,因此確定發(fā)酵周期為48 h。

2.5 接種量對(duì)甘露醇發(fā)酵的影響

培養(yǎng)36 h的種子,以接種量5%,10%,15%,20%和25%分別接到發(fā)酵培養(yǎng)基中,厭氧培養(yǎng)48 h后檢測菌體量及甘露醇質(zhì)量濃度,參見圖5。

由圖5可見,隨著接種量的增加,菌體濕重隨之增加,而甘露醇的質(zhì)量濃度在20%的接種量時(shí)最多,所以最佳的接種量為20%。

2.6 p H值對(duì)甘露醇發(fā)酵的影響

改變發(fā)酵初始p H值,p H值設(shè)定為3.0,4.0,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,8.0,9.0,10.0,發(fā)酵時(shí)保持p H值不變,參見圖6,由圖6可以看出發(fā)酵時(shí)p H值在6.5附近時(shí)菌體量最高,低于5.0、高于8.0菌體長勢不好。最終發(fā)酵的p H值定為6.5。

2.7 溫度對(duì)甘露醇發(fā)酵的影響

將種子轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中,保持p H值為6.5,于不同溫度(20,28,35,40,50℃)下厭氧培養(yǎng),以菌體濕重為指標(biāo)考察溫度對(duì)發(fā)酵的影響,參見圖7。

由圖7可以看出,布氏乳桿菌在35℃生長最好,40℃以上菌體幾乎不長。故將發(fā)酵溫度定于35℃。

2.8 氧氣對(duì)甘露醇發(fā)酵的影響

布氏乳桿菌可以兼性生長,比較了好氧與厭氧2種培養(yǎng)方式對(duì)甘露醇產(chǎn)生的影響。好氧發(fā)酵條件:裝液量50 m L/250 mL,搖瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng),轉(zhuǎn)速為180 r/min;厭氧發(fā)酵條件:裝液量200 mL/250 m L,靜止培養(yǎng)。其他條件不變,測定菌體濕重和發(fā)酵結(jié)束時(shí)甘露醇質(zhì)量濃度,結(jié)果見表4。

好氧發(fā)酵時(shí)葡萄糖的消耗多,菌體生長快,果糖的消耗少,甘露醇生成量低;厭氧發(fā)酵時(shí),結(jié)果正好相反,葡萄糖的消耗少,菌體生長慢,果糖的消耗多,甘露醇生成量高,驗(yàn)證了厭氧條件下,果糖加氫轉(zhuǎn)化甘露醇的機(jī)理。

2.9 碳源質(zhì)量濃度對(duì)甘露醇發(fā)酵的影響

圖7 溫度對(duì)CICC 6007菌體生長的影響Fig.7 Effect of temperature on grow th of CICC 6007

表4 氧氣對(duì)甘露醇發(fā)酵的影響Tab.4 Effect of oxygen on mannitol fermentation

由于果糖價(jià)格較高,根據(jù)異型乳酸發(fā)酵的厭氧代謝途徑,可以由葡萄糖替代部分果糖的作用,同時(shí)可以提高果糖的轉(zhuǎn)化率,以果糖與葡萄糖質(zhì)量比為2∶1進(jìn)行發(fā)酵,設(shè)定總糖質(zhì)量濃度分別為60,90,120,150,210 g·L-1,其余發(fā)酵培養(yǎng)基配方不變,于30 ℃靜止培養(yǎng),發(fā)酵48 h,結(jié)果見表5。

表5 不同糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下葡萄糖、果糖、甘露醇的變化量Tab.5 Variation of glucose,fructose and mannitol at different concentration of sugar

表5的結(jié)果表明,隨著總糖質(zhì)量濃度的增加,甘露醇的產(chǎn)生量也相應(yīng)增大,果糖與葡萄糖的消耗比值為2.54～3.06,在總糖質(zhì)量濃度為150 g/L時(shí),甘露醇的產(chǎn)量趨于穩(wěn)定,達(dá)到68.5 g/L,此時(shí)甘露醇對(duì)果糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到78.7%。

3 結(jié) 論

1)以布氏乳桿菌(L actobacillus buchneri)CICC 6007為研究菌株,優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基,確立了發(fā)酵工藝條件。

2)通過對(duì)布氏乳桿菌生長規(guī)律的研究,確立了主要工藝條件為厭氧發(fā)酵,發(fā)酵初始p H值為6.5,發(fā)酵溫度為35℃,接種齡為36 h,接種量為20%,發(fā)酵周期為48 h。

3)當(dāng)1 L培養(yǎng)基組成為5 g蛋白胨,5 g牛肉膏,5 g酵母膏,2 g檸檬酸二銨,2 g乙酸鈉,2 g磷酸氫二鉀,50 g葡萄糖,100 g果糖,50 mg M gSO4,50 mg M nSO4,50 mg ZnSO4,1 m L吐溫80及1 m L復(fù)合維生素時(shí),甘露醇產(chǎn)量為68.5 g/L,甘露醇對(duì)果糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到78.7%。

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Research in fermentation conditions ofLactobacillus buchneriCICC 6007 for p roduction of mannitol

HOU Jian-ge1,2,WANG Fang2,WANG Li-li2,ZHAO Chang-xin1
(1.School of Biological and Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian Liaoning 116034,China;2.Collegeof Biological Science and Engineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang Hebei 050018,China)

The fermentation conditions ofLactobacillus buchneriCICC 6007 fo r p roduction of mannitol were studied in the paper.The results show s that the yield of mannitol is p roportional to the cell wet weight.The culturemedium containing 150 g/L total sugar,in w hich the ratio of fructose to glucose is 3,is inoculated w ith 20%seed culture grow n at 35℃and p H 6.5 for 36 h,then goes to anaerobic fermentation for 48 h.The yield of mannitol is 68.5 g/L and the rate of convertion from fructose to mannitol is 78.7%.

mannitol;fermentation;Lactobacillus buchneri

TQ920.1

A

1008-1542(2010)02-0132-05

2009-11-02;責(zé)任編輯:張 軍

侯建革(1971-),男,河北靈壽人,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,碩士研究生,主要從事發(fā)酵產(chǎn)品方面的研究。

趙長新教授,E-mail:zhaochangxin@126.com