萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體遺傳分化的空間格局

項(xiàng)賢領(lǐng), 席貽龍, 溫新利, 張晉艷, 馬 芹

（安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；安徽省高?！吧锃h(huán)境與生態(tài)安全”省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000）

萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體遺傳分化的空間格局

項(xiàng)賢領(lǐng), 席貽龍*, 溫新利, 張晉艷, 馬 芹

（安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；安徽省高?！吧锃h(huán)境與生態(tài)安全”省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000）

對(duì)采自中國(guó)東部8個(gè)地理區(qū)域中的萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體（Brachionus calyciflorusspecies complex）內(nèi)124個(gè)輪蟲克隆的核DNA ITS區(qū)進(jìn)行了測(cè)序和分析，重建了萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)生樹。研究發(fā)現(xiàn)，73個(gè)單倍型聚合為3個(gè)支系，支系間序列差異百分比為4.2%～25.3%，表明萼花臂尾輪蟲實(shí)際上是由3個(gè)隱種組成的種復(fù)合體，在廣州、儋州和蕪湖采樣點(diǎn)均具有隱種共存現(xiàn)象。萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的核苷酸多樣性和單倍型多樣性均較高，隱種Ⅲ內(nèi)各種群間遺傳分化指數(shù)也較高，這可能是由于棲息地片段化和有限的基因流導(dǎo)致的。另外在冰期瓶頸后拓殖種群的快速增長(zhǎng)也阻礙了有效基因流，并加速了地理種群間的遺傳分化。巢式支系分析顯示部分巢支具有一定的系統(tǒng)地理格局，而Mantel檢驗(yàn)表明，種群間平均凈遺傳距離及遺傳分化指數(shù)和地理距離間均無(wú)顯著相關(guān)性。末次盛冰期之后的新仙女木事件（Younger Dryas Event，YD）可能對(duì)我國(guó)萼花臂尾輪蟲隱種的分布和地理格局造成較大影響。在YD時(shí)期，3個(gè)萼花臂尾輪蟲隱種可能退縮并共存于南嶺以南地區(qū)的多個(gè)殘遺種避難所，而此后的休眠卵長(zhǎng)距離拓殖并伴隨后期的棲息地片段化可能是形成當(dāng)前地理格局的主要原因。萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體在全球范圍內(nèi)的地理分布可能與大陸板塊構(gòu)造運(yùn)動(dòng)有關(guān)。

萼花臂尾輪蟲；種復(fù)合體；遺傳分化；空間格局；巢式支系分析；系統(tǒng)地理學(xué)

系統(tǒng)地理學(xué)是研究物種及物種內(nèi)不同種群形成現(xiàn)有分布格局的歷史原因和演化過(guò)程的一門學(xué)科，其研究的核心是遺傳譜系空間分布的歷史特征（Avise & Hamrick, 1996）。通過(guò)對(duì)種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析來(lái)探討種內(nèi)系統(tǒng)地理格局的形成機(jī)制、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及現(xiàn)有分布特征，并結(jié)合種群的地理分布狀況來(lái)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證與其相關(guān)的地質(zhì)事件，追溯和揭示種群的進(jìn)化歷程（Avise et al, 1987; Avise, 1998），這對(duì)理解種群分化、物種形成、生態(tài)適應(yīng)和歷史氣候變化等進(jìn)程具有重要意義（Avise, 2000）。生物體分布格局的形成原因不僅包括生物因素（如擴(kuò)散、適應(yīng)、物種形成、滅絕以及生物之間的相互作用等），還應(yīng)當(dāng)包括地理歷史因素（如板塊構(gòu)造運(yùn)動(dòng)、海平面升降、氣候變化和海洋洋流變化等）（Chen et al, 2006）。山脈、河流等自然地理?xiàng)l件對(duì)生物擴(kuò)散具有一定的隔離屏障作用，維持甚至加速了種群的局域性分化（Hebert et al, 2003; Taylor et al, 1998; Cox & Hebert, 2001）。地理歷史上的拓殖事件以及物種分布區(qū)的擴(kuò)張或退縮也會(huì)對(duì)種群的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響。我國(guó)是惟一跨越六大動(dòng)物地理區(qū)（古北界、新北界、舊熱帶界、東洋界、新熱帶界和澳洲界）中兩個(gè)主要地理區(qū)（古北界與東洋界）的國(guó)家, 加之地處歐亞大陸東南端，地球地質(zhì)歷史上的一些重大事件（如印度板塊與歐亞板塊的碰撞、青藏高原的隆起以及末次盛冰期以來(lái)的新仙女木事件等）都對(duì)我國(guó)的氣候和動(dòng)物地理分布產(chǎn)生直接影響，使得我國(guó)成為研究世界動(dòng)物區(qū)系演化與生物地理學(xué)的關(guān)鍵地區(qū)之一（Miao et al, 2003）。

目前，系統(tǒng)地理學(xué)研究主要集中在對(duì)高等動(dòng)植物系統(tǒng)地理格局的分析上（Taberlet & Bouvet, 1994; Johnson et al, 1999; Fernando et al, 2000; Edwards & Gadek, 2001），而關(guān)于浮游動(dòng)物系統(tǒng)地理學(xué)的研究?jī)H局限于枝角類溞屬（Daphnia）（Hebert, 1987; Innes, 1991; De Meester, 1996; Vanoverbeke & De Meester, 1997; Weider et al, 1999a, b; Hebert et al, 2003; Penton et al, 2004; De Gelas & De Meester, 2005）、褶皺臂尾輪蟲種復(fù)合體（Brachionus plicatilisspecies complex）（Gómez et al, 2000, 2002a, b; Gómez, 2005; Mills et al, 2007）和螅狀獨(dú)縮蟲（Miao et al, 2003），其中的原因除了長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為大多數(shù)浮游動(dòng)物種群可以休眠體形式通過(guò)風(fēng)力、水流和水禽等介質(zhì)傳播而形成全球性分布以至于不存在地理分化外，還由于浮游動(dòng)物個(gè)體小，尋找不同種群間形態(tài)結(jié)構(gòu)差異相對(duì)比較困難（Miao et al, 2003）。迄今為止，關(guān)于浮游動(dòng)物的系統(tǒng)地理格局主要包括以下兩種不同的觀點(diǎn)：一種觀點(diǎn)認(rèn)為少數(shù)有建群效應(yīng)的休眠體在經(jīng)歷了歷史拓殖事件后，種群會(huì)有一個(gè)快速增長(zhǎng)期，從而有效阻止了由基因流引起的等位基因頻率的變化（Boileau et al, 1992）。此外，這些定殖種群對(duì)棲息地環(huán)境的快速適應(yīng)（De Meester, 1993, 1996; Okamura & Freeland, 2002）以及它們所擁有的龐大的休眠卵庫(kù)（Hairston, 1996）均進(jìn)一步強(qiáng)化了建群效應(yīng)的持久性。因此，這些種群表現(xiàn)出高度的遺傳分化和顯著的系統(tǒng)地理格局（Gómez et al, 2000, 2002a, b, 2007; Gómez, 1997, 2005; Hebert, 1998; Mills et al, 2007），種群間的遺傳距離隨著地理距離的增加而增加。這些進(jìn)程已由De Meester et al（2002）整合定名為“獨(dú)占假說(shuō)”；另一種觀點(diǎn)認(rèn)為由于浮游動(dòng)物在整個(gè)休眠卵階段具有高度的擴(kuò)散能力，休眠體的長(zhǎng)距離拓殖限制了種群分化和局域性適應(yīng)，從而使得種群間遺傳距離比期望值小，遺傳多樣性降低，無(wú)法形成系統(tǒng)的地理格局，種群間遺傳距離和地理距離間沒有顯著的相關(guān)性（Weider et al, 1999a; Innes, 1991; Dong & Niu, 2004; Mergeay et al, 2005; Ishida & Taylor, 2007; Mu?oz et al, 2008）。

浮游動(dòng)物多樣的地理分布格局可能與其隱種混雜和季節(jié)替代有關(guān)。大多數(shù)浮游動(dòng)物都具有高度的擴(kuò)散能力和廣泛的地理分布（Hebert, 1987; Ruttner-Kolisko, 1974; Koste, 1978; Wallace & Snell; 2001），廣布種在其分布區(qū)常常表現(xiàn)出廣泛的形態(tài)變異，如高度的表型可塑性或周期變形，以及由于高度的形態(tài)停滯而引起的形態(tài)學(xué)一致性（De Gelas & De Meester, 2005），這些均會(huì)導(dǎo)致我們對(duì)隱性物種形成的忽視（Hutchinson, 1967; Knowlton, 1993; Hebert, 1998），從而使得許多物種的確定可能存在錯(cuò)誤。近期的分子系統(tǒng)學(xué)研究表明，這些在較大地理尺度上分布的廣布種，尤其是來(lái)自不同大陸的地理種群間存在多個(gè)遺傳譜系或隱種（Taylor et al, 1998; Gómez et al, 2000, 2002b; Cox & Hebert, 2001; Hebert et al, 2003; Penton et al, 2004; Gilbert & Walsh, 2005），所謂的廣布種事實(shí)上可能是隱種復(fù)合體（Gómez et al, 2002b; Gómez, 2005; Gilbert & Walsh, 2005; Ciros-Pérez et al, 2001; Derry et al, 2003），即使在較小的地理范圍內(nèi)，這些廣布種的地理種群間也存在高度的遺傳分化（Hebert, 1987; Carvalho, 1994; De Meester, 1996; Ortells et al, 2000, 2003; Gómez et al, 2002b; Suatoni, 2003; Gómez, 2005; Li et al, 2008）。另外，在同一水體中還存在季節(jié)種群間的遺傳分化或隱種共存（Gómez et al, 1995; Ortells et al, 2003; Cheng et al, 2008）。因此，種群遺傳結(jié)構(gòu)研究中必須首先進(jìn)行物種分化的相關(guān)研究，尤其是當(dāng)該物種被懷疑可能存在隱種時(shí)（Ortells et al, 2003），從而避免隱種混雜和季節(jié)替代對(duì)輪蟲種群遺傳分化的空間格局分析產(chǎn)生干擾。

萼花臂尾輪蟲（Brachionus calyciflorus）是常見的淡水輪蟲種類之一，具有典型的周期性孤雌生殖特點(diǎn)，長(zhǎng)期被看做是世界性分布的廣布種。然而，近期的研究表明，它也是一個(gè)種復(fù)合體（Gilbert & Walsh, 2005; Cheng et al, 2008; Li et al, 2008）。有關(guān)萼花臂尾輪蟲的系統(tǒng)地理學(xué)研究目前只涉及少數(shù)地理區(qū)域（Dong & Niu, 2004），在較大地理尺度上對(duì)其種群遺傳分化的空間格局研究尚未見報(bào)道。

為了避免輪蟲種群遺傳結(jié)構(gòu)的季節(jié)變異對(duì)空間格局分析可能產(chǎn)生的影響，本研究選擇在各采樣點(diǎn)間水溫差異最小（28～35℃）時(shí)（2007年7月和8月）進(jìn)行了樣品采集。以核DNA ITS序列（ITS1-5.8S-ITS2）為分子標(biāo)記，對(duì)采自中國(guó)東部沿緯度梯度分布的8個(gè)地理區(qū)域的124個(gè)萼花臂尾輪蟲克隆進(jìn)行測(cè)序和分析，以便我們正確認(rèn)識(shí)輪蟲種群遺傳分化的空間格局和形成機(jī)制，探明輪蟲隱種同域共存的歷史原因。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和DNA提取

圖 1 萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體采集點(diǎn)分布圖Fig. 1 Sampling localities for Brachionus calyciflorus species complex in this study

實(shí)驗(yàn)用萼花臂尾輪蟲于2007年7—8月分別采自中國(guó)天津、德州、泰安、徐州、南京、蕪湖、安慶、南昌、贛州、廣州和儋州（圖1）。采集輪蟲樣品的同時(shí)，測(cè)定水溫、pH值和氨氮濃度等水體理化因子（表1）。樣品采集后，于各地理種群內(nèi)分別挑取約200個(gè)萼花臂尾輪蟲雌體，在自然光照（光照強(qiáng)度約130 lx，L∶D=14∶10和與采樣點(diǎn)水溫相近的溫度條件下進(jìn)行克隆培養(yǎng)。培養(yǎng)液采用Gilbert（1963）配方（pH=7.3），所用餌料為HB-4培養(yǎng)基（Li et al, 1959）培養(yǎng)的、處于指數(shù)增長(zhǎng)期的斜生柵藻（Scenedesmus obliquus），培養(yǎng)時(shí)間在1個(gè)月以上。當(dāng)各克隆輪蟲達(dá)較高密度（200～300 ind./mL）時(shí)，用輪蟲培養(yǎng)液過(guò)濾沖洗，饑餓24 h后用70%酒精固定保存。由于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)輪蟲克隆培養(yǎng)難度較大，只有部分輪蟲個(gè)體的克隆培養(yǎng)獲得成功；贛州、南昌和泰安等3個(gè)地理種群由于僅建立1～2個(gè)克隆而未被使用，最終124個(gè)輪蟲克隆數(shù)據(jù)被納入本次分析。

用玻璃粉法提取基因組DNA（Xiang et al, 2006）。具體方法為：離心獲得輪蟲樣品，置于1.5 mL Eppendorf管中，加500 μL DNA提取緩沖液（0.5% SDS，25 mmol/L EDTA，25 mmol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）和20 μL蛋白酶K（20 μg/mL），置60℃水浴2 h；加500 μL 8 mol/L預(yù)熱后的硫氰酸胍和40 μL（1∶1）的潔凈玻璃粉乳液，混勻后置37℃水浴1 h，不時(shí)搖動(dòng)；取出4 000 r/min離心2 min，棄去上清液；沉淀用70%冰乙醇清洗2次，再用丙酮清洗1次；置真空干燥機(jī)中干燥。加TE（pH8.0）40 μL，置56℃水浴30 min，取出，8 000 r/min離心2 min，吸上清液，置?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

PCR擴(kuò)增在Bio-Rad公司生產(chǎn)的iCycler擴(kuò)增儀上進(jìn)行。ITS序列（ITS1-5.8S-ITS2）引物為寶生物工程（大連）有限公司合成的LH2（5'-GTCGAATTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA-3'）和Dlam （5'-CCTGCAGTCGACAKATGCTTAARTTCAGCRGG-3'）（Xi et al, 2003）。反應(yīng)體系包括1×Buffer，0.2 mmol/L dNTP，0.2 μmol/L引物，2 mmol/L Mg2+，DNA模板4 μL，4 U的Taq酶，超純水補(bǔ)至50 μL。擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1.5 min，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL EB）中電泳檢測(cè)，并使用AxyPrepTMPCR純化試劑盒（AXYGEN）純化，然后連接到pMD 19-T載體（Takara）并轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α大腸桿菌體內(nèi)。用質(zhì)粒提取試劑盒提取含有目的片段的質(zhì)粒DNA，ABIPRISM 3730型自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定。

表 1 采樣點(diǎn)信息Tab. 1 Summary information of sampling localities in this study

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用CLUSTAL X（1.8）軟件（Thompson et al, 1997）進(jìn)行序列對(duì)位排列，并輔以人工校對(duì)；用DNASTAR軟件計(jì)算兩兩序列的序列差異百分比；再用DnaSP 5.1軟件（Librado & Rozas, 2009）分析變異位點(diǎn)、多態(tài)位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、單倍型多樣性（h）、核苷酸多樣性（π）和種群間平均凈遺傳距離（Da）。

為了在更大范圍內(nèi)探討輪蟲譜系關(guān)系，本研究引用了GenBank中用于探討萼花臂尾輪蟲譜系關(guān)系的ITS序列，它們分別采自喬治亞（Georgia）、佛羅里達(dá)（Florida）、德克薩斯（Texas）和澳大利亞（Australia）（Gilbert & Walsh, 2005）以及中國(guó)蕪湖（Wuhu）（Zhang, 2009），序列登錄號(hào)分別為DQ071668-DQ071671和EU978878。以剪形臂尾輪蟲（B. forficula）為外群，運(yùn)用PAUP*4.0b10軟件（Swofford, 2002），采用啟發(fā)式搜索的方法，分別以最大似然法（maximum likelihood，ML）、最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony，MP）和鄰接法（neighbor joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。 采用Modeltest 3.7（Posada & Crandall, 1998）中的赤池信息準(zhǔn)則（Akaike information criterion, AIC）檢測(cè)用于ML分析的最佳模型，模型檢測(cè)表明，最適模型為TVM+G（P＜0.001），Base = (0.2953 0.1752 0.1806)，Nst=6，Rmat=(1.1595 3.8251 2.5981 0.5005 3.8251)，Rates=gamma，Shape=0.8567。MP和NJ系統(tǒng)樹各結(jié)點(diǎn)的支持率以序列數(shù)據(jù)集1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)的自引導(dǎo)值（Bootstrap value）（Felsenstein, 1985）表示，而ML系統(tǒng)樹則以100次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)的自引導(dǎo)值表示。貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)樹利用MrBayes 3.1.2軟件（Ronquist & Huelsenbeck, 2003）進(jìn)行，其中馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法（Markov Chain Monte Carlo）設(shè)置為4條鏈（3條熱鏈、1條冷鏈）同時(shí)運(yùn)行，重復(fù)一次。采用最適合的DNA進(jìn)化模型TVM+G，以隨機(jī)樹為起始樹，運(yùn)行6 00萬(wàn)代，每100代抽樣一次，在舍棄老化樣本后，根據(jù)剩余的樣本構(gòu)建一致樹，節(jié)點(diǎn)置信度以后驗(yàn)概率（posterior probability, PP）評(píng)價(jià)。

應(yīng)用Arlequin 3.1（Excoffier & Schneider, 2005）中的分子變異分析（analysis of molecular variance, AMOVA）方法檢測(cè)種群間和種群內(nèi)的遺傳變異組成并估算地理種群遺傳分化指數(shù)（F-statistics，F(xiàn)st）。同時(shí)，利用Arlequin軟件包中的Mantel統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)（Mantel, 1967），分別比較平均凈遺傳距離（Da）和遺傳分化指數(shù)（Fst）與地理距離矩陣之間的相關(guān)性，并進(jìn)行1 000次重復(fù)的顯著性檢驗(yàn)。采樣點(diǎn)環(huán)境因子（水溫、年平均氣溫、pH值和氨態(tài)氮濃度）與種群遺傳學(xué)參數(shù)（單倍型多樣性h、核苷酸多樣性π以及遺傳分化指數(shù)Fst）間的相關(guān)性分析采用SPSS 16.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）完成。

ITS序列單倍型之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系用Network 4.510（Bandelt et al, 1999; available from http://www.fluxus-engineering.com）程序中的Median-Joining進(jìn)行分析。這樣得到的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系樹是一種無(wú)根的系統(tǒng)進(jìn)化樹，各單倍型之間由突變連接。然后按照Templeton et al（1987）和Templeton & Sing（1993）組巢原則構(gòu)建單倍型巢式支系圖：處在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系樹邊緣、只與一個(gè)支系或單倍型連接的支系或單倍型稱為末支（tip clade）；而與一個(gè)以上支系或單倍型連接的支系或單倍型稱為內(nèi)支（interior clade）。通常認(rèn)為，在同一支系內(nèi)，末支和內(nèi)支分別代表了在進(jìn)化上較晚和較早的支系或單倍型（Castelloe & Templeton, 1994）。組巢的基本原則是從單倍型水平開始，將末支與其相連的內(nèi)支組為一個(gè)一級(jí)支系；之后再對(duì)一級(jí)支系對(duì)應(yīng)的末支、內(nèi)支組巢成為二級(jí)支系，直到單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系樹組為一個(gè)大的完整支系為止。基于巢式支系圖，進(jìn)行巢式支系分析（nested clade analysis, NCA）：首先利用Geodis 2.5程序（Posada et al, 2000）計(jì)算不同支系（從一級(jí)支系到一個(gè)大的支系）內(nèi)兩種類型的距離，巢內(nèi)距離（Dc）表示某支系或某單倍型所有個(gè)體與該支系或該單倍型地理分布中心的平均距離，即該支系的地理分布范圍；巢間距離（Dn）表示某支系或某單倍型所有個(gè)體與包含該支系的高一級(jí)水平地理分布中心的平均距離，即該支系與進(jìn)化上相近的支系間的地理分布關(guān)系；另外，在所有組巢水平各個(gè)支系內(nèi)還要計(jì)算內(nèi)支兩種距離均值與末支兩種距離均值之差（即各個(gè)支系內(nèi)I-T的Dc和Dn）。同時(shí)，通過(guò)1 000次的隨機(jī)選擇來(lái)檢驗(yàn)上述數(shù)值的顯著性大??；最后，根據(jù)上述的兩種距離結(jié)果，參照Templeton（2004）給出的對(duì)巢式支系圖不同水平支系距離格局的檢索表推測(cè)單倍型地理分布格局的歷史成因。

2 結(jié) 果

2.1 萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的序列變異和遺傳多樣性

萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體內(nèi)124個(gè)克隆的ITS區(qū)序列長(zhǎng)度在759～785 bp之間，比對(duì)后長(zhǎng)809 bp，其中變異位點(diǎn)253 bp，多態(tài)位點(diǎn)226 bp，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)185 bp，從而定義了73個(gè)單倍型。A、T、C和G堿基平均含量分別為28.9%、36.2%、16.6%和18.3%，其中A＋T含量（65.1%）明顯高于C＋G含量（34.9%），表現(xiàn)出明顯的反G偏倚。儋州樣品的A+T含量稍有偏高（65.9%），C＋G含量較平均值稍微偏低（34.1%），其它各采樣點(diǎn)樣品間的堿基組成變化不大。所有樣品測(cè)序結(jié)果已提交至GenBank（序列登錄號(hào)GU012678-GU012801）。大部分單倍型都分布在單一采樣點(diǎn)中，另外有12個(gè)共享單倍型分布在兩個(gè)或兩個(gè)以上的采樣點(diǎn)（表2）。平均核苷酸多樣性和單倍型多樣性分別為0.0529（±0.0078SD）和0.960（±0.008SD）（表2），各采樣點(diǎn)樣品的核苷酸多樣性（π）與單倍型多樣性（h）之間并不呈現(xiàn)顯著的相關(guān)關(guān)系。廣州、儋州、南京和蕪湖樣品的核苷酸多樣性均高于平均核苷酸多樣性。對(duì)各采樣點(diǎn)樣品間凈遺傳距離（Da）的分析顯示，蕪湖樣品和徐州樣品與其他各采樣點(diǎn)樣品間具有較高的Da值（表3）。

2.2 系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

運(yùn)用貝葉斯法、最大似然法、最大簡(jiǎn)約法（未示出）和鄰接法（未示出）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致（圖2—3），均將73個(gè)單倍型分成3個(gè)支系：支系Ⅰ（Clade Ⅰ）、支系Ⅱ（Clade Ⅱ）和支系Ⅲ（Clade Ⅲ），且置信度較高。支系Ⅰ涵蓋的單倍型數(shù)最少（7個(gè)），全部為來(lái)自儋州采樣點(diǎn)的樣品；支系Ⅱ包括了13個(gè)儋州單倍型、11個(gè)廣州單倍型、2個(gè)蕪湖單倍型和1個(gè)儋州與廣州共享單倍型；剩下的39個(gè)單倍型全部歸入支系Ⅲ，分布于8個(gè)采樣點(diǎn)。所有73個(gè)單倍型間序列差異百分比為0%～25.3%，平均5.97%，最大的序列差異位于共享單倍型SH9和單倍型HN14間。支系Ⅰ、支系Ⅱ和支系Ⅲ內(nèi)部的ITS區(qū)序列差異百分比分別為0%～1.7%、0%～0.8%和0%～2.4%；支系Ⅰ和支系Ⅱ，支系Ⅰ和支系Ⅲ以及支系Ⅱ和支系Ⅲ間的序列差異百分比分別為23.7%～25.3%、23.9%～25.3%和4.2%～6.2%。根據(jù)Gilbert & Walsh（2005）對(duì)不同地理品系萼花臂尾輪蟲的交配實(shí)驗(yàn)和ITS區(qū)序列分析結(jié)果，不同地理品系萼花臂尾輪蟲間ITS區(qū)序列差異百分比大于4%時(shí)具有生殖隔離，為不同的隱種。因此本研究中的這3個(gè)支系應(yīng)該屬于不同的隱種，在本文中分別臨時(shí)命名為隱種Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。

表1羅列了PISA與中考數(shù)學(xué)在不同內(nèi)容主題上的分布，可清楚地得出PISA題和中考題對(duì)運(yùn)算和幾何概念考察比例相差不大，不過(guò)中考題的三角幾何知識(shí)所占比例較大；PISA題的數(shù)據(jù)展示、統(tǒng)計(jì)和概率相加達(dá)到34%，高于中考題；另一方面，中考題包括函數(shù)的知識(shí)，而在PISA題內(nèi)并未涉及，而PISA題中涉及的測(cè)量和消費(fèi)者應(yīng)用方面，在中考題中也未出現(xiàn).表2羅列了從認(rèn)知要求維度上的分布情況，可得兩者執(zhí)行程序認(rèn)知所占的比例都非常高，中考題涉及的回憶的知識(shí)和證明題較多，而PISA題中解決非常規(guī)問(wèn)題比例較高.因此PISA題傾向與要求學(xué)生解決一些實(shí)際問(wèn)題，建立數(shù)學(xué)和實(shí)際的聯(lián)系，而中考題側(cè)重考察學(xué)生對(duì)知識(shí)的掌握情況.

表 2 萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體各采樣點(diǎn)的樣品數(shù)、單倍型、核苷酸多樣性和單倍型多樣性(±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 2 Sample size, haplotypes, nucleotide and haplotype diversity (±SD) for each geographic population in Brachionus calyciflorus complex

表 3 萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體各采樣點(diǎn)樣品間平均凈遺傳距離（Da，對(duì)角線上）和分化程度（Fst，對(duì)角線下）以及樣品內(nèi)分化程度（Fst，對(duì)角線）Tab. 3 Average pairwise difference between populations (Da, above diagonal), Fst among (below diagonal) and within (on the diagonal) geographic populations in Brachionus calyciflorus complex

來(lái)自喬治亞（Georgia DQ071668）和佛羅里達(dá)（Florida DQ071669）的萼花臂尾輪蟲隱種被歸入支系Ⅲ，它們與支系Ⅲ內(nèi)部各克隆間序列差異百分比為0.8%～3.2%；與支系Ⅱ間序列差異百分比為5.5%～6.7%；與支系Ⅰ間序列差異百分比為24.8%～25.6%。因此，喬治亞和佛羅里達(dá)的萼花臂尾輪蟲隱種與支系Ⅲ為同一譜系。來(lái)自中國(guó)蕪湖的萼花臂尾輪蟲隱種（Wuhu China EU978878）被歸入支系Ⅱ，其與支系Ⅱ內(nèi)部各克隆間序列差異百分比為0.1%～0.5%；與支系Ⅰ內(nèi)部各克隆間序列差異百分比為24.4%～25.2%；與支系Ⅲ內(nèi)部各克隆間序列差異百分比為4.6%～6%。因此，中國(guó)蕪湖的萼花臂尾輪蟲隱種與支系Ⅱ?yàn)橥蛔V系；而來(lái)自德克薩斯和澳大利亞的萼花臂尾輪蟲隱種均作為一個(gè)單獨(dú)的支系被獨(dú)立出來(lái)，德克薩斯萼花臂尾輪蟲隱種（Texas DQ071670）與支系I、支系II和支系III間的序列差異百分比分別為25.9%～26.7%、4.5%～5.1%和3.8%～4.5%；澳大利亞萼花臂尾輪蟲隱種（Australia DQ071671）與支系I、支系II和支系III間的序列差異百分比分別為25%～25.8%、7.1%～7.8%和5.6%～6.9%。

2.3 種復(fù)合體內(nèi)隱種Ⅲ的遺傳多樣性、種群遺傳分化和系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)

考慮到隱種Ⅰ內(nèi)僅含有儋州種群，隱種Ⅱ內(nèi)含有儋州、廣州和蕪湖種群，且蕪湖種群僅有兩個(gè)單倍型（WH21和WH23）。因此，下面的種群遺傳分化和系統(tǒng)地理格局分析僅包括隱種Ⅲ內(nèi)的6個(gè)地理種群的38個(gè)單倍型（由于儋州和廣州種群都僅含一個(gè)單倍型，因此未被包括在內(nèi)）。

隱種Ⅲ的平均核苷酸多樣性和單倍型多樣性分別為(0.0096±0.0008)和(0.918±0.018)，均低于萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的核苷酸多樣性和單倍型多樣性，尤其是核苷酸多樣性。各種群的核苷酸多樣性（π）與單倍型多樣性（h）之間并不呈現(xiàn)顯著的相關(guān)關(guān)系。AMOVA分析顯示，隱種Ⅲ內(nèi)各種群間具有較高的遺傳分化水平（種群間變異為32.61%，種群內(nèi)變異為67.39%，F(xiàn)st=0.3261）。種群間凈遺傳距離（Da）的分析顯示，徐州種群與其他各地理種群間具有很高的Da值；種群間的分化程度（Fst）也同樣遵循這種規(guī)律（表4）。

Mantel檢驗(yàn)結(jié)果表明，隱種Ⅲ內(nèi)各地理種群間的遺傳距離（Da）和遺傳分化程度（Fst）（表4）并不隨空間距離的增加而增大，兩對(duì)矩陣未發(fā)現(xiàn)有顯著的相關(guān)性（P=0.999）；萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的Da和Fst（表3）與各采樣點(diǎn)間的距離也無(wú)顯著的相關(guān)性（P=0.923）。

相關(guān)分析表明，隱種Ⅲ內(nèi)地理種群的遺傳學(xué)參數(shù)（單倍型多樣性、核苷酸多樣性以及遺傳分化指數(shù)）與采樣點(diǎn)的環(huán)境因子（水溫、年平均氣溫、pH值和氨態(tài)氮濃度）間均沒有顯著的相關(guān)性；但采樣點(diǎn)的年平均氣溫與萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的核苷酸多樣性呈顯著正相關(guān)（r=0.720，P＜0.05），與遺傳分化指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=?0.717，P＜0.05）。

圖 2 基于ITS序列的萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的ML系統(tǒng)發(fā)生樹Fig. 2 ML phylogenetic tree of Brachionus calyciflorus species complex based on ITS sequences

2.4 巢式支系分析

根據(jù)組巢原則得到的萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體內(nèi)73個(gè)單倍型的巢式支系圖的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖4）與貝葉斯及最大似然法系統(tǒng)樹（圖2—3）基本一致。73個(gè)單倍型組成了16個(gè)一級(jí)支系、6個(gè)二級(jí)支系和3個(gè)三級(jí)支系。根據(jù)Templeton et al（1992）的判斷程序，由于3個(gè)三級(jí)支系之間的分歧已超過(guò)95%的簡(jiǎn)約性連接置信限度，因此這3個(gè)支系之間并沒有連接。

圖 3 基于ITS序列的萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)生樹Fig. 3 Bayesian phylogenetic tree of Brachionus calyciflorus species complex based on ITS sequences

表 4 隱種Ⅲ內(nèi)各地理種群間平均凈遺傳距離（Da，對(duì)角線上）、種群間遺傳分化程度（Fst，對(duì)角線下）、種群內(nèi)遺傳分化程度（Fst，對(duì)角線）、核苷酸多樣性和單倍型多樣性Tab. 4 Average pairwise difference between populations (Da, above diagonal), Fst among (below diagonal) and within (on the diagonal) populations, nucleotide diversity and haplotype diversity in cryptic species Ⅲ

圖 4 萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體內(nèi)單倍型網(wǎng)絡(luò)圖和巢支設(shè)計(jì)Fig. 4 Haplotype networks and nested clade design for all unique Brachionus calyciflorus species complex haplotypes

經(jīng)巢支設(shè)計(jì)，萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體內(nèi)73個(gè)單倍型組成3個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。網(wǎng)絡(luò)圖Ⅰ僅由7個(gè)來(lái)自儋州的單倍型組成，其中共享單倍型SH12可能為祖先單倍型；網(wǎng)絡(luò)圖Ⅱ中大部分是來(lái)自儋州（13個(gè)）和廣州（11個(gè)）的單倍型，此外還有兩個(gè)來(lái)自蕪湖的單倍型和一個(gè)共享單倍型SH11；剩下的所有單倍型被歸入網(wǎng)絡(luò)圖Ⅲ，其中在多個(gè)采樣點(diǎn)間共享的單倍型SH5可能是最原始的單倍型。 3個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖間具有顯著的遺傳分歧，與單倍型系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果相一致。

巢式支系分析（NCA）得到的所有組巢水平各個(gè)支系內(nèi)的內(nèi)支、末支和內(nèi)外支的巢內(nèi)距離（Dc）和巢間距離（Dn）之差以及顯著性大小值（P）的結(jié)果見表5。單倍型分布與其地理位點(diǎn)間的隨機(jī)關(guān)系零假設(shè)在部分巢支中被拒絕，呈現(xiàn)出一定的系統(tǒng)地理格局。根據(jù)檢索表分析推測(cè)到的各個(gè)單倍型地理分布格局的一系列歷史成因見表6。支系2-2、2-4和3-3由長(zhǎng)距離拓殖并可能伴隨后期的棲息地片段化形成；支系2-5，由于距離隔離情況下有限的基因流造成的；支系3-2，由于樣本量有限而無(wú)法辨別是距離隔離還是長(zhǎng)距離擴(kuò)散影響了其地理分布格局。支系3-1，由于代表的是隱種Ⅰ，且只包括一個(gè)地理種群，故無(wú)法分析其地理格局。

3 討 論

3.1 萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體和隱種Ⅲ的遺傳多樣性

在兩個(gè)隨機(jī)選擇的DNA序列間平均每個(gè)核苷酸位點(diǎn)的差異數(shù)，也許更能反映種群的遺傳變異水平（Nei & Li, 1979）。單倍型多樣性和核苷酸多樣性越高，種群遺傳多樣性就越豐富。本研究中，萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的核苷酸多樣性較高，單倍型多樣性也很高；而萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體內(nèi)隱種Ⅲ的平均核苷酸多樣性和單倍型多樣性均低于萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的核苷酸多樣性和單倍型多樣性，尤其是核苷酸多樣性指數(shù)；這可能是由于萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體已分化為3個(gè)隱種的緣故。

表 5 基于巢式支系圖（圖4），應(yīng)用程序Geodis 2.5對(duì)萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體內(nèi)73個(gè)單倍型數(shù)據(jù)進(jìn)行巢式支系分析（NCA）得到的有顯著差異水平的巢內(nèi)距離（Dc）和巢間距離（Dn）Tab. 5 Two distances with significant difference obtained from the nested cladistic analysis (NCA) of 73 haplotypic data of Brachionus calyciflorus complex based on the nested cladogram given in Fig. 4 and Geodis 2.5 program＊

表 6 基于對(duì)萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體內(nèi)73個(gè)單倍型數(shù)據(jù)的巢式支系分析結(jié)果（表5），應(yīng)用Templeton（2004）的檢索表分析得到的一系列推論Tab. 6 Chain of inference from the nested clade analysis of 73 haplotypic data of Brachionus calyciflorus complex (Tab. 5) using Templeton’s (2004) inference key

3.2 萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

隱性物種形成在許多橈足類和枝角類等微型無(wú)脊椎動(dòng)物中已被廣泛研究（Taylor & Hebert, 1992; Lee, 2000; Knowlton, 2000; Lee & Frost, 2002; Dodson et al, 2003; Penton et al, 2004; Kim et al, 2006）。此前的分子生物學(xué)研究已經(jīng)表明在世界性分布的輪蟲種復(fù)合體內(nèi)，核DNA ITS序列分歧較大，萼花臂尾輪蟲為4%～6.8%（Gilbert & Walsh, 2005）和5.1%～8.8%（Cheng et al, 2008），褶皺臂尾輪蟲的ITS1區(qū)間序列差異為3%～20%（Gómez et al, 2002b）。與此相似，本研究中萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體內(nèi)單倍型間序列差異百分比為0%～25.3%，平均5.97%；3個(gè)支系間序列差異百分比為4.2%～25.3%，表明萼花臂尾輪蟲實(shí)際上是一個(gè)包含3個(gè)隱種的種復(fù)合體。由于以其他種類無(wú)脊椎動(dòng)物的分歧速率作為參考是不可靠的（Thomas et al, 2006），所以很難由ITS序列數(shù)據(jù)估測(cè)得到這3個(gè)隱種的分歧時(shí)間。在廣州、儋州和蕪湖采樣點(diǎn)發(fā)現(xiàn)有萼花臂尾輪蟲隱種的同域共存現(xiàn)象，在儋州采樣點(diǎn)有3個(gè)隱種同域共存（隱種Ⅰ、隱種Ⅱ和隱種Ⅲ），廣州和蕪湖采樣點(diǎn)各兩個(gè)隱種（隱種Ⅱ和隱種Ⅲ），其他各采樣點(diǎn)均只有一個(gè)隱種。

3.3 隱種Ⅲ的種群遺傳分化和系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)

棲息地片段化和有限的基因流是形成當(dāng)前物種分布格局的主要原因，它們可以阻礙種群間的基因交流而使其產(chǎn)生遺傳分化，甚至導(dǎo)致生殖隔離，形成新的物種。在本研究中，較高的遺傳分化指數(shù)（Fst=0.3261）表明隱種Ⅲ在各地理種群間分化顯著；根據(jù)Templeton（2004）檢索表推測(cè)到的隱種Ⅲ地理分布格局的歷史成因包括長(zhǎng)距離拓殖并可能伴隨后期的棲息地片段化以及在距離隔離情況下的有限基因流。此外，冰期瓶頸后拓殖種群優(yōu)先到達(dá)并占領(lǐng)棲息地，快速的種群增長(zhǎng)阻礙了來(lái)自種群間的有效基因流，從而加速了地理種群間的遺傳分化。

有些環(huán)境因子，如水體的鹽度和水溫，對(duì)姐妹種的分布和種群的遺傳分化程度有重要影響（Gómez et al, 1995; Lowe et al, 2007; Yu et al, 2008）。運(yùn)用乙酸纖維素電泳法，Gómez et al（1995）研究了西班牙卡斯特隆沿海Torreblanca濕地的3個(gè)間歇性池塘的褶皺臂尾輪蟲種群的遺傳變異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆群之間的生態(tài)學(xué)特性存在特化現(xiàn)象，且對(duì)應(yīng)著特定的鹽度和溫度。在本研究中，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，采樣點(diǎn)年平均氣溫與萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的核苷酸多樣性指數(shù)（π）呈顯著的正相關(guān)，與遺傳分化指數(shù)（Fst）呈顯著的負(fù)相關(guān)；而其余環(huán)境因子與遺傳多樣性指數(shù)間均沒有顯著的相關(guān)性，這表明萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體在各采樣點(diǎn)間的遺傳分化程度可能受到諸如氣溫等環(huán)境因子的影響。

一般來(lái)說(shuō)，輪蟲、橈足類、枝角類和介形類動(dòng)物均具有持久的奠基者效應(yīng)、地域性的特有分布現(xiàn)象以及伴隨著基因流潛在減少而存在的顯著地理格局（Boileau et al, 1992; Hebert & Wilson, 1994; Weider et al, 1999a; Gómez et al, 2000; Schon et al, 2000; Mills et al, 2007），輪蟲種群的遺傳譜系間具有較強(qiáng)的地理空間結(jié)構(gòu)，基因流小，且地理距離和遺傳距離間具有顯著的相關(guān)性（Gómez et al, 2000）。然而，Hatton-Ellis et al（1998）研究的淡水苔蘚動(dòng)物Cristatella mucedo以及Dong & Niu（2004）研究的萼花臂尾輪蟲卻沒有呈現(xiàn)出顯著的系統(tǒng)地理格局。在本研究中，巢式支系分析表明，有些單倍型（如SH1、SH2和SH5）以較高的頻率在多個(gè)采樣點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)，這些單倍型可能是祖先單倍型，它們可能參與了冰期后的棲息地?cái)U(kuò)張，并作為奠基者在各采樣點(diǎn)保留下來(lái)，從而形成了相似的地理分布格局。因此，遺傳距離和地理距離間并無(wú)顯著的相關(guān)性。

3.4 萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的演化歷史

生物種群內(nèi)和種群間的遺傳變異在地理上的分布模式一直是進(jìn)化遺傳學(xué)家關(guān)注的核心問(wèn)題之一（Avise, 2000）。歷史過(guò)程和環(huán)境因素均對(duì)物種分化和現(xiàn)有分布格局的形成具有重要影響。物種在進(jìn)化史上發(fā)生的一些事件，如物種分布區(qū)的擴(kuò)張與退縮、奠基者效應(yīng)、生境的片段化和重大地質(zhì)事件等都會(huì)對(duì)種群現(xiàn)存的遺傳變異水平產(chǎn)生影響。另外，環(huán)境因素，如山脈、河流等自然地理?xiàng)l件對(duì)生物擴(kuò)散具有一定的隔離屏障作用，維持甚至加速了種群的局域性分化（Hebert et al, 2003; Taylor et al, 1998; Cox & Hebert, 2001）。通過(guò)比較物種間或種群間的系統(tǒng)地理分布模式可以勘察物種或種群進(jìn)化歷史的一般模式，揭示物種或種群的進(jìn)化進(jìn)程（Bermingham & Avise, 1986; Hewitt, 2000）。

本研究發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)絡(luò)圖部分巢支呈現(xiàn)出一定的系統(tǒng)地理格局，其所揭示的物種演化歷史與通過(guò)分子系統(tǒng)學(xué)方法得到的萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體的遺傳分化是一致的；但是種群遺傳距離和地理距離間并無(wú)顯著的相關(guān)性。在儋州采樣點(diǎn)有3個(gè)隱種同域共存，而在廣州和蕪湖地區(qū)均有兩個(gè)隱種同域共存。

廣州、儋州和蕪湖地區(qū)的隱種共存可能與這些地理種群的進(jìn)化歷史、擴(kuò)散和適應(yīng)能力有關(guān)。通過(guò)孢粉學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，末次盛冰期以來(lái)的新仙女木事件（Younger Dryas Event，YD）在我國(guó)華南地區(qū)也有所表現(xiàn)，這一事件在歐洲、北美和我國(guó)北方都早有記載（Xiao et al, 1998）。約在10 400 a BP前后，在我國(guó)南方南嶺地區(qū)（24°15′N，115°2′E）

——廣東省和江西省的交界處（圖1陰影部分）有一次持續(xù)數(shù)百年的氣候降溫波動(dòng)，但這一事件在我國(guó)南北方不同的氣候帶內(nèi)的表現(xiàn)形式是不一樣的，南方地區(qū)不如北方地區(qū)明顯和劇烈，南方地區(qū)表現(xiàn)為涼、濕，而北方地區(qū)表現(xiàn)為冷、干，這可能與東亞季風(fēng)活動(dòng)效應(yīng)有關(guān)（Xiao et al, 1998）。因此，本研究中的3個(gè)萼花臂尾輪蟲隱種可能是在YD時(shí)期退縮并遺存于包括儋州和廣州在內(nèi)的南嶺以南地區(qū)的多個(gè)殘遺種避難所。在南嶺山地屏障阻礙下，3個(gè)隱種在儋州和廣州地區(qū)共存。新仙女木事件之后，萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體開始向更遠(yuǎn)的中國(guó)北方地區(qū)擴(kuò)散。隱種Ⅲ的少數(shù)具有高拓殖能力的休眠體可能首先到達(dá)并占領(lǐng)北方各棲息地，拓殖事件之后，這些休眠體對(duì)局域環(huán)境的高度適應(yīng)能力和快速的種群增長(zhǎng)減少了來(lái)自種群間的基因流，并且有效地增加了奠基者效應(yīng)的持久性，使得最初的建群者所攜帶的等位基因頻率可以延續(xù)上萬(wàn)代。由于初期的拓殖者有能力快速地增長(zhǎng)到較大的種群數(shù)量，從而在若干代以后迅速飽和被占領(lǐng)的棲息地并獨(dú)占特定的生態(tài)位，這樣就沖淡了后來(lái)的遷徙者的影響。在隱種Ⅲ的“優(yōu)先效應(yīng)（priority effects）”（Boileau et al, 1992; Mu?oz et al, 2008）作用下，隱種Ⅱ中只有兩個(gè)單倍型通過(guò)長(zhǎng)距離擴(kuò)散拓殖到蕪湖采樣點(diǎn)，沒有繁殖體拓殖到更遠(yuǎn)的長(zhǎng)江以北地區(qū)，這可能與長(zhǎng)江的阻隔或隱種Ⅱ的擴(kuò)散和適應(yīng)能力較差有關(guān)。相比較而言，隱種Ⅰ僅僅分布于儋州地區(qū)，連具有相似生境特點(diǎn)的棲息地，如廣州地區(qū)也未能成功拓殖，這可能是由于種群過(guò)小、擴(kuò)散能力差以及瓊州海峽（圖1）的屏障作用導(dǎo)致的。

浮游動(dòng)物的世界性分布已在多個(gè)種類中被證實(shí)，這可能與其橫貫大陸的長(zhǎng)距離擴(kuò)散或拓殖能力有關(guān)（Gómez et al, 2002b; De Gelas & De Meester, 2005）。本研究發(fā)現(xiàn)，萼花臂尾輪蟲種復(fù)合體在全球范圍內(nèi)的地理分布還可能與大陸板塊構(gòu)造運(yùn)動(dòng)有關(guān)。中生代晚期，印度從馬達(dá)加斯加分離，正加速撞向勞亞大陸(Laurasia)。值得注意的是，此時(shí)北美仍與歐亞大陸相連，澳大利亞仍然是南極洲的一部分。因此，推測(cè)廣泛分布在我國(guó)境內(nèi)的萼花臂尾輪蟲由于近似的自然地理?xiàng)l件和無(wú)明顯的天然阻礙可能時(shí)常與北美大陸種群間發(fā)生基因交流，并未發(fā)生隱種和種群間的遺傳分化；但由于特提斯海（Tethys sea）的阻隔，勞亞大陸和澳洲大陸間的萼花臂尾輪蟲發(fā)生了種群分化。新生代早期，印度?歐亞板塊的碰撞導(dǎo)致了青藏高原和喜馬拉雅山脈的隆升，使亞洲，甚至全球范圍內(nèi)古地理、古氣候和生物區(qū)系格局發(fā)生了劇烈的調(diào)整，原本與南極洲相連的澳洲，此時(shí)也開始迅速向北移動(dòng)，此后就再也未與其它大陸相連，因此推測(cè)澳洲板塊上的萼花臂尾輪蟲隱種即澳大利亞隱種形成的時(shí)間最早，與本研究結(jié)果吻合。此后全球大陸板塊變化較小，北美大陸和歐亞大陸的萼花臂尾輪蟲未發(fā)生隱種分化，同為隱種Ⅲ。本研究中Texas隱種、隱種Ⅰ和隱種Ⅱ的出現(xiàn)可能為萼花臂尾輪蟲隱種Ⅲ在北美大陸和歐亞大陸的同域性物種形成的產(chǎn)物。

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Spatial Patterns of Genetic Differentiation inBrachionus calyciflorusSpecies Complex

XIANG Xian-Ling, XI Yi-Long*, WEN Xin-Li, ZHANG Jin-Yan, MA Qin

(College of Life Sciences, Anhui Normal University; Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province, Wuhu241000,China)

To understand spatial patterns of genetic differentiation in theBrachionus calyciflorusspecies complex, the rDNA ITS regions of 124 rotifer clones collected from eight geographic regions in East China were sequenced and analyzed. A total of 73 haplotypes were defined, and were grouped into three clades by the phylogenetic trees. The divergences of ITS sequence among the three clades ranged from 4.2% to 25.3%, indicating the occurrence of three cryptic species (cryptic species Ⅰ, cryptic species Ⅱ and cryptic species Ⅲ). The sympatric co-occurrence of these cryptic species was observed at Guangzhou, Danzhou and Wuhu. The nucleotide diversity inB. calycifloruscomplex was higher, and so was haplotype diversity. Within cryptic species III, the higher genetic differentiation might be attributed to fragmentation and restricted gene flow. In addition, the rapid increase of colonizers after an ambiguous glacial bottleneck might interfere with effective gene flow and accelerate genetic differentiation of geographic populations. The nested clade analysis suggested to some extent the geographic structure, and the non-significant correlation existed between the geographic distance and the average pairwise difference between populations (Da) as well asFst. The Younger Dryas（YD）Event after the last full glacial period might has considerable effect on the patterns of geographic structure and distribution of crypticB. calyciflorusspecies. During the YD event, the three cryptic species probably retreated and co-occurred in multiple relict refugia to the south of Nanling area. Long-distance colonization possibly coupled with subsequent fragmentation might be the main reason of the current patterns of geographic structure. The geographic distribution ofB. calycifloruscomplex on a global scale might be attributed to the motion of continental plates.

book=31,ebook=213

Brachionus calyciflorus; Species complex; Genetic differentiation; Spatial pattern; Nested clade analysis; Phylogeography

Q349.1; Q958.12;Q178.51

A

0254-5853-(2010)03-0205-016

10.3724/SP.J.1141.2010.03205

2009-12-04；接受日期：2010-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（30770352, 30499341）；安徽省優(yōu)秀青年基金（08040106904）；安徽省教育廳自然科學(xué)基金（KJ2009B089Z）；“重要生物資源保護(hù)和利用研究”安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)基金資助；安徽師范大學(xué)青年基金資助項(xiàng)目（2008xqn71）

*通訊作者（Corresponding author），E-mail: ylxi1965@yahoo.com.cn

項(xiàng)賢領(lǐng)（1978 - ），男，博士生，講師，主要從事分子生態(tài)學(xué)和系統(tǒng)地理學(xué)研究