強(qiáng)電離放電·OH致死有害細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)

武建芳,張芝濤,蔡麗嬌

(大連海事大學(xué)環(huán)境工程研究所,遼寧大連 116026)

強(qiáng)電離放電·OH致死有害細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)

武建芳,張芝濤,蔡麗嬌

(大連海事大學(xué)環(huán)境工程研究所,遼寧大連 116026)

采用噴嘴對(duì)·OH進(jìn)行載體噴霧定量殺菌實(shí)驗(yàn),研究·OH的衰減程度及其對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌黑色變種的滅活作用;并通過測(cè)定不同濃度·OH對(duì)細(xì)菌作用后產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物量和蛋白質(zhì)漏出量,研究了·OH對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌黑色變種細(xì)胞損傷的情況.結(jié)果表明:應(yīng)用椎型噴嘴(孔徑3.18 mm,水壓0.49 M Pa)和扇型扇形噴嘴(孔徑3.57 mm,水壓0.63 M Pa)噴霧后的霧滴粒徑可以有效地降低·OH衰減,對(duì)有害細(xì)菌的殺滅率都可達(dá)到《消毒技術(shù)規(guī)范》要求.

強(qiáng)電場(chǎng)放電;·OH;大腸桿菌;枯草芽孢桿菌黑色變種;載體噴霧定量殺菌

近年來,各種流行病異?？疋?新傳染疾病的種類和出現(xiàn)速度超過了以往任何時(shí)期,有害病菌的防范和殺滅已經(jīng)成為人類生存的又一個(gè)重大挑戰(zhàn).目前,國(guó)內(nèi)外有效的化學(xué)消毒產(chǎn)品主要有戊二醛[1]、二氧化氯[2]、環(huán)氧乙烷[3-4].這些產(chǎn)品總體存在的問題是:消毒作用慢;價(jià)格偏高;需要祛除殘留,會(huì)造成二次污染;對(duì)人體有害,可能致癌;部分細(xì)菌出現(xiàn)了抗藥性.

Hoigne[5]等人在1976年提出了以羥基自由基(hyd roxyl radical,·OH)產(chǎn)生為標(biāo)志的先進(jìn)氧化技術(shù)(AOP).強(qiáng)電離放電產(chǎn)生·OH的方法,不產(chǎn)生或極少產(chǎn)生副產(chǎn)品;·OH參與的反應(yīng)屬于游離基反應(yīng),它與微生物、有機(jī)物的反應(yīng)速率常數(shù)在109L/(mo l·s)左右,反應(yīng)速率快;·OH攻擊有害生物以及各種污染物,降解為CO2,H2O及無機(jī)鹽,沒有二次污染.基于·OH的各種優(yōu)點(diǎn),其滅菌效果也有人報(bào)道[6],但·OH以噴霧的方式噴出,衰減嚴(yán)重,本文的創(chuàng)新點(diǎn)在于應(yīng)用不同噴嘴,通過增加·OH霧滴粒徑的方式,減小·OH衰減,來實(shí)現(xiàn)良好的殺菌效果.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 壓力控制

通過直流穩(wěn)壓電源(RXN-3010D,兆信電子儀器)輸出電壓大小控制微型水泵(HSP11050-24V,成都為誠(chéng)電子機(jī)械商行)的輸出壓力,實(shí)現(xiàn)壓力參數(shù)改變.

1.1.2 噴嘴

PZ5070QZ:噴霧形狀為錐形,噴孔直徑2.00 mm,角度80°;WL 11/2-30 BSP:噴霧形狀為錐形,噴孔直徑2.77 mm,角度30°;WL 11/2-60 BSP:噴霧形狀為錐形,噴孔直徑2.77 mm,角度60°;WL 2-30 BSP:噴霧形狀為錐形,噴孔直徑3.18 mm,角度30°;WL2-60 BSP:噴霧形狀為錐形,噴孔直徑3.18 mm,角度60°.這5種噴嘴的角度能夠完全覆蓋圖1中2,4,13位置,WL 11/2-30BSP,WL 11/2-60BSP和WL 2-30BSP,WL 2-60BSP能夠達(dá)到考察不同噴灑角度對(duì)殺滅效果的影響.

PZ50100B:噴霧形狀為扇形,噴孔直徑2.00 mm,角度60°;NF20-30:噴霧形狀為扇形,噴孔直徑2.78 mm,角度60°;NF20-60:噴霧形狀為扇形,噴孔直徑2.78 mm,角度60°;N F30-30:噴霧形狀為扇形,噴孔直徑3.57 mm,角度60°;NF30-60:噴霧形狀為扇形,噴孔直徑3.57 mm,角度60°,不同的噴孔直徑能達(dá)到在同樣壓力下改變噴霧霧滴粒徑的目的,利用N F20-30,N F20-60和N F30-30,N F30-60能夠考察不同噴灑角度對(duì)殺滅效果的影響,達(dá)到邊角滅菌的目的.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程

為測(cè)量噴霧后·OH濃度及進(jìn)行平面及空間實(shí)驗(yàn),根據(jù)噴淋裝置的可噴霧面積,特設(shè)計(jì)如圖1實(shí)驗(yàn)裝置.其規(guī)格為:每個(gè)小孔直徑6 cm,2孔徑圓心間距15 cm,2板間隔25.0 cm,面板長(zhǎng)75 cm,寬45 cm,2支撐柱之間的距離橫向42 cm,縱向42 cm.實(shí)驗(yàn)時(shí)分別將染菌片放置在各個(gè)標(biāo)號(hào)處,用·OH溶液進(jìn)行載體定量噴霧實(shí)驗(yàn).

高濃度·OH溶液制取工藝流程如圖2所示,白希堯[7]等采用特殊的電介質(zhì)層,特殊的加工工藝,自制等離子體發(fā)生裝置,O2和H2O通過預(yù)處理進(jìn)入等離子體源,在強(qiáng)電場(chǎng)電離放電的作用下產(chǎn)生高濃度·OH, ·OH進(jìn)入到新式氣液溶解器中經(jīng)充分溶解,使·OH高效地溶入溶液,含高濃度·OH的溶液再通過氣液溶解分離器和剩余氣體去除器,分離除去多余的氣體后,便獲得高濃度·OH溶液.

1.2.2 載體定量噴霧殺菌實(shí)驗(yàn)

大腸桿菌(Escherichia coli,A TCC 8099),枯草芽孢桿菌黑色變種(Bacillus subtilisvar.niger,ACTT 9372),購置于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心.實(shí)驗(yàn)時(shí)取普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂24 h新鮮培養(yǎng)物,用5 m L磷酸鹽緩沖液(PBs)稀釋成為(107～108)cfu/m L的懸液.取0.01 mL該菌懸液均勻涂于直徑為12 mm直徑圓形玻璃片,將染菌后的菌片放在直徑為6 cm的無菌平皿內(nèi),每個(gè)平皿放3個(gè),成三角形排列,將無菌平皿分別放在圖1編號(hào)的不同位置上,用噴霧系統(tǒng)進(jìn)行載體定量噴霧滅菌實(shí)驗(yàn).每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.處理后的樣片經(jīng)充分振蕩洗脫成菌懸液,取樣進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù).滅菌效果以E表示,按下式計(jì)算[8].

式中:N0為陽性對(duì)照組樣品生長(zhǎng)菌落數(shù);Nt為實(shí)驗(yàn)組樣品生長(zhǎng)菌落數(shù).

1.2.3 膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的測(cè)定

取108cfu/m L的菌懸液,加入一定量不同濃度的·OH溶液,立即混勻,95℃水浴煮沸40 min, 4 000 r/m in離心10 min,取上清液,參照TBA[9]比色法,吸取上清液于535 nm比色.

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

取108cfu/mL左右的菌懸液,加入一定量不同濃度的·OH溶液,立即混勻,參照考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 不同錐形噴嘴影響下,·OH對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌黑色變種的作用效果

在水壓0.49 M Pa,噴灑密度40.56μL/cm2,實(shí)驗(yàn)室溫度9℃,濕度40%,原·OH質(zhì)量濃度2.21 mg/L,在圖1中2,4,13位置取樣(實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值).研究了通過不同噴嘴將·OH噴霧后,·OH濃度衰減及滅菌情況.由圖3可知,經(jīng)5種不同噴嘴噴霧后,·OH的衰減分別為原來的0.28,0.35,0.38,0.40,0.42倍,原因是同樣壓力下,噴嘴孔徑越大,霧滴粒徑就越大,·OH衰減就越小;噴嘴的角度也影響·OH濃度衰減,由于噴嘴的角度小,使得殺滅位置處在噴霧范圍的邊緣,影響了滅菌效果.由圖4可知,噴霧后·OH衰減越小,滅菌效果越好.WL2-60BSP噴嘴的滅菌效果最好,大腸桿菌初始對(duì)數(shù)值為5.71時(shí),滅菌對(duì)數(shù)值為4.10;枯草芽孢桿菌黑色變種初始對(duì)數(shù)值為5.71時(shí),滅菌對(duì)數(shù)值為2.93.

2.2 不同空間高度影響下,·OH對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌黑色變種的作用效果

在水壓0.41 M Pa,所用噴嘴型號(hào)WL 2-60BSP噴灑密度40.56μL/cm2,實(shí)驗(yàn)室溫度6℃,濕度40%,原·OH質(zhì)量濃度2.28 mg/L,研究結(jié)果為圖1中2,4,13位置取樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值,大腸桿菌初始對(duì)數(shù)值7.44,枯草芽孢桿菌黑色變種初始對(duì)數(shù)值6.54條件下.以一定高度噴灑·OH溶液并進(jìn)行滅菌實(shí)驗(yàn),在不同空間高度下取樣后研究·OH濃度衰減程度及大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的死亡情況.由圖5可知,隨著空間高度的增加,·OH的衰減也逐漸增加;由圖6可知,由于空間高度的增加導(dǎo)致·OH衰減,濃度逐漸下降,所以滅菌率也逐漸降低,但是在空間高度1.40 m的情況下噴霧殺菌,·OH的衰減仍然不是很大,所以在遠(yuǎn)距離也可以應(yīng)用·OH滅菌.

2.3 不同扇形噴嘴影響下,·OH對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌黑色變種的作用效果

在噴頭處水壓為0.63 M Pa,噴灑密度為40.56μL/cm2,實(shí)驗(yàn)室溫度為8℃,濕度為45%,研究結(jié)果為圖1中7,9位置取樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值.由圖7可知,經(jīng)5種扇形噴嘴噴霧后,·OH的衰減程度和滅菌效果均有所不同,噴嘴孔徑越大,·OH的衰減程度越小;原因是噴嘴孔徑越大,噴霧霧滴粒徑越大,·OH衰減就越小.噴嘴的角度也影響·OH濃度衰減,由于噴嘴的角度小,使得殺滅位置處在噴霧范圍的邊緣,影響了滅菌效果.由圖8可知,由于不同扇形噴嘴噴霧后導(dǎo)致·OH衰減程度不同,對(duì)細(xì)菌的殺滅效果也不同,衰減越小,滅菌效果越好.大腸桿菌初始對(duì)數(shù)值為6.61時(shí),NF30,NF50 2種噴嘴的滅菌效果均達(dá)到了100%殺滅.枯草芽孢桿菌黑色變種初始對(duì)數(shù)值為5.88時(shí),NF30,NF50 2種噴嘴的滅菌對(duì)數(shù)值為3.63,3.82.

2.4 ·OH對(duì)細(xì)菌細(xì)胞通透性的影響

·OH作用于細(xì)菌,使膜壁受到損傷,導(dǎo)致蛋白質(zhì)泄露.由圖9可知,大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的蛋白質(zhì)泄露量隨著·OH質(zhì)量濃度的增加都不斷增加,說明·OH能夠殺死細(xì)菌,并且導(dǎo)致蛋白質(zhì)泄露.·OH質(zhì)量濃度為0.84 m g/L時(shí),大腸桿菌的蛋白質(zhì)泄露量出現(xiàn)了降低的趨勢(shì),原因是當(dāng)·OH質(zhì)量濃度達(dá)到0.84 mg/L時(shí),蛋白質(zhì)的泄露量已經(jīng)小于其被氧化的量,說明大腸桿菌已經(jīng)大部分死亡,但是枯草芽孢桿菌的蛋白質(zhì)泄露量還在逐漸增加,這也恰恰說明了枯草芽孢桿菌比大腸桿菌較難殺死.

2.5 ·OH對(duì)細(xì)菌脂質(zhì)過氧化物含量的影響

·OH能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(PUEA),引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用,并因此形成脂質(zhì)過氧化物,如醛基(丙二醛MDA),因此,測(cè)試MDA的量可以反映生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,從而間接地反映出細(xì)胞的損傷程度[10-11].實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10,結(jié)果表明,·OH使大腸桿菌脂質(zhì)過氧化,是大腸桿菌死亡的重要原因,并且隨著·OH質(zhì)量濃度的增加,破壞程度越嚴(yán)重.在·OH質(zhì)量濃度為0.58 mg/L時(shí),大腸桿菌的MDA含量出現(xiàn)了下降的趨勢(shì),可能的原因是·OH不但氧化破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu),而且將產(chǎn)生的丙二醛也氧化.

3 結(jié)論

·OH噴霧后滅菌效果主要取決于它的衰減程度,衰減越小,即·OH濃度越大,滅菌效果越好.·OH的衰減程度受噴霧霧滴粒徑的影響,而霧滴粒徑又由噴嘴的孔徑和噴頭處的水壓決定.實(shí)驗(yàn)表明:1)WL 2-60BSP型噴嘴(孔徑3.18,水壓0.49 M Pa)和NF30,NF50型扇形噴嘴(孔徑3.57,水壓0.63 M Pa)具有相對(duì)最大的霧滴粒徑,最小的·OH衰減,并且衰減后的·OH濃度可以有效殺滅有害細(xì)菌.2)在空間高度為140 cm時(shí),·OH的衰減仍然可以滿足滅菌要求.3)對(duì)強(qiáng)電場(chǎng)電離·OH滅菌機(jī)理的研究表明,·OH破壞細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu),使蛋白質(zhì)泄露,使細(xì)菌脂質(zhì)過氧化,是大腸桿菌死亡的重要原因,隨著·OH濃度增加,·OH還可能將細(xì)菌胞內(nèi)物質(zhì)直接氧化降解,完全破壞細(xì)菌細(xì)胞.

[1]銀濤.戊二醛消毒劑的研究進(jìn)展[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志,2005,21(3):297-300.

[2]胡雙啟,晉日亞.氣體二氧化氯滅菌特性研究[J].中北大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(4):346-348.

[3]黃靖雄.環(huán)氧乙烷滅菌[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2004,14(12):1435-1439.

[4]張霞,周雯,王有森.環(huán)氧乙烷在滅菌物品中殘留量測(cè)定及毒性研究進(jìn)展[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志,2005,22(2):217-218.

[5]HARDW ICK TJ.The free radical mechanism in the reactionsof hydrogen peroxide[J].Can J Chem,1957,35(3):428.

[6]BA IM ingdong,ZHAO Dongyan,XU Hongtao,et al.Experimental studies on elimination ofEscherichia coliand bacillus subtilis using hydroxyl radicals p roduced by strong Ionization discharge[J].Plasma Science and Technology,2008,10(4): 463-465.

[7]白希堯,白敏冬,周曉見,等.羥基及其藥劑制取方法研究[J].化工時(shí)刊,2002(4):1-5.

[8]PUREVDORJD,IGURA N,HA YAKAWA I,et a1.Inactivation ofEscherichia coliby microw ave induced low temperature argon p lasma treatments[J].Journal of Food Engineering,2002,53:341-346.

[9]龐戰(zhàn)軍,周玫,陳璦.自由基醫(yī)學(xué)研究方法[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:62.

[10]方允中,李文杰.自由基與酣[M].北京:科學(xué)出版社,1989:63-85.

[11]趙克然,楊毅軍,曹道俊.氧自由基與臨床[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,1999:23-24.

Experimental on Killing Harmful Bacterium by the ·OH Produced by Strong-field Ion ization Discharge

WU Jian-fang,ZHANG Zhi-tao,CAILi-jiao
(Institute of Environmental Engineering,Dalian Maritime Univisity,Dalian 116026,China)

The experiment of carrier quantitative sp ray sterilization was conducted w ith sp ray nozzle to study the attenuation of hydroxyl radical and sterilization.The quantity of p rotein 1eakage and the p roduction of lipid peroxide in bacterial suspension killed by different concentration of hydroxyl radical were measured to analyse the inactivation mechanism s.The result show ed that verteb ral type of nozzle that diameter was 3.18 mm and p ressure was 0.49 M Pa could effectively reduce·OH decay,The same as the type of fan nozzle that diameter was 3.57 mm and p ressure was 0.63 M Pa.The killing rate of the harmful bacteria could achieve“sterilization technical specifications”requirement.·OH could damage bacterial p roteins,make the cellmembrane lipid peroxidation,and could damage the genetic material of bacteria.

strong-field ionization discharge;hydroxyl radical;Escherichia coli;Bacillus subtilisvar. niger;carrier quantitative sp ray sterilization

Q 89

A

1000-1565(2010)05-0551-05

2010-03-05

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2008CB41723)

武建芳(1982—),女,河北張家口人,大連海事大學(xué)在讀碩士研究生,主要從事等離子體環(huán)境污染治理研究.

(責(zé)任編輯:梁俊紅)