制備型高效液相法分離苦瓜抑菌活性成分

孟曉，馬力

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

制備型高效液相法分離苦瓜抑菌活性成分

孟曉，馬力*

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

選擇200目～300目硅膠為柱填料，以抑菌效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用制備型高效液相法（Pre－HPLC）對(duì)苦瓜提取液浸膏中的抑菌活性成分進(jìn)行分離。結(jié)果表明：當(dāng)流動(dòng)相配比石油醚（60℃～90℃）∶乙酸乙酯為7∶3，進(jìn)樣量0.5 mL，流速5 mL/min時(shí)，檢測(cè)器在280 nm波長處所檢測(cè)到的物質(zhì)抑菌效果最好，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯，抑菌圈直徑為12 mm，對(duì)照組沒有抑菌效果。

制備型高效液相法；苦瓜；抑菌

苦瓜（Momordica charantia L.）又稱涼瓜，是葫蘆科苦瓜屬植物。據(jù)研究表明[1-3]，苦瓜作為一種藥食同源的瓜類蔬菜，具有增強(qiáng)免疫能力、抑菌、降血糖、抗癌、抗腫瘤、抗氧化、治療糖尿病、治療艾滋病等藥理作用。

近十幾年來，隨著人們對(duì)分離與純化技術(shù)的不斷探索，色譜分離技術(shù)得到了迅速發(fā)展，制備高效液相色譜法已成為當(dāng)代高效分離技術(shù)的研究前沿，用于制備高質(zhì)量的生物活性物質(zhì)[4-5]。本文以抑菌效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用制備型高效液相法（Pre－HPLC）對(duì)苦瓜提取液中的抑菌活性成分進(jìn)行分離，旨在獲得具有較好抑菌效果的一類物質(zhì)，為下一階段對(duì)該類物質(zhì)相關(guān)性質(zhì)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

苦瓜粉：市場(chǎng)自購。

1.1.2 試劑

石油醚（60℃～90℃）、乙酸乙酯、無水乙醇、營養(yǎng)瓊脂：分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.1.3 菌種

大腸桿菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由西華大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.4 儀器

AKTA Purifier10制備型高效液相色譜儀：GE公司；SHB-3循環(huán)水多用真空泵：鄭州杜甫儀器廠；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生氏儀器廠；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎儀：寧波新芝科器研究所；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

以70%乙醇為溶劑，采用超聲波輔助提取苦瓜粉，用二氯甲烷萃取提取液，水浴揮干溶劑，得苦瓜提取液浸膏；準(zhǔn)確稱取苦瓜提取液浸膏0.50 g，無水乙醇溶解，配制成濃度為50 mg/mL的溶液，過0.45 μm的微孔濾膜，供分析和制備用。

1.2.2 色譜條件

自填硅膠柱（12 mm×300 mm，200目～300目）；流動(dòng)相：石油醚-乙酸乙酯；流速5mL/min；檢測(cè)波長280nm；進(jìn)樣量 50 μL。

1.2.3 洗脫液收集

采用制備型高效液相系統(tǒng)對(duì)按照1.2.1處理好的樣品在1.2.2的色譜條件下進(jìn)行分離，按照出峰順序收集洗脫液，濃縮，揮干流動(dòng)相，干燥備用。

1.2.4 抑菌效果評(píng)價(jià)

用無菌鑷子將滅菌后的濾紙片（6 mm）放入1.2.3的樣品液中，浸泡0.5 h后取出，揮發(fā)掉乙醇；吸取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液于無菌平皿中，均勻地涂布于凝固的培養(yǎng)基表面；將含樣品的紙片貼于平板上，每種設(shè)3個(gè)重復(fù)，然后以無菌水作為對(duì)照，放入培養(yǎng)箱中，37℃下培養(yǎng)24 h。取出測(cè)定抑菌圈直徑，取其平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品粗分離與抑菌效果比較

在流動(dòng)相:石油醚-乙酸乙酯（9∶1）；流速 5 mL/min；檢測(cè)波長280 nm；進(jìn)樣量50 μL的色譜條件下對(duì)1.2.1的樣品進(jìn)行分離，得到色譜圖如圖1所示。

如圖1所示，利用上述色譜條件對(duì)1.2.1的樣品液進(jìn)行分離后，在280 nm波長處共檢測(cè)到4個(gè)峰，其中1號(hào)峰和2號(hào)峰都是在流動(dòng)相配比為石油醚：乙酸乙酯（9∶1）時(shí)洗脫下來的，說明這兩種物質(zhì)都屬于弱極性物質(zhì)；而3號(hào)峰和4號(hào)峰則是用無水乙醇洗脫下來的，因此這兩類物質(zhì)可以歸為極性物質(zhì)。最后，按照1.2.3的處理方法對(duì)各洗脫液進(jìn)行處理，分別取等量各干燥樣品，等體積無水乙醇溶解，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果表明：在2號(hào)峰處收集的洗脫液抑菌效果最好，其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有較為明顯的抑制效果，其抑菌圈直徑分別為13 mm和12 mm。結(jié)果見圖2。

2.2 樣品細(xì)分離與抑菌效果比較

改變色譜條件，即流動(dòng)相∶石油醚-乙酸乙酯（7∶3）；流速 5 mL/min；檢測(cè)波長 280 nm；進(jìn)樣量 50 μL。在此條件下對(duì)2.1中的2號(hào)峰洗脫液進(jìn)行再分離，得到色譜圖如圖3所示。

可知，利用上述色譜條件對(duì)2號(hào)峰的洗脫液進(jìn)行分離后，在280 nm波長處共檢測(cè)到三個(gè)峰，其中2-1號(hào)峰和2-2號(hào)峰都是在流動(dòng)相配比為石油醚：乙酸乙酯（7∶3）時(shí)洗脫下來的，說明這兩種物質(zhì)都屬于弱極性物質(zhì)；而2-3號(hào)峰則是用無水乙醇洗脫下來的，因此這類物質(zhì)可以歸為極性物質(zhì)。最后，按照1.2.3的處理方法對(duì)各洗脫液進(jìn)行處理，分別取等量各干燥樣品，等體積無水乙醇溶解，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果見圖4。

圖4結(jié)果表明：在2-2號(hào)峰處收集的洗脫液抑菌效果最好，其對(duì)金黃色葡萄球菌有較為明顯的抑制效果，抑菌圈直徑為12 mm，但其對(duì)大腸桿菌沒有明顯的抑制作用。

3 結(jié)論

通過試驗(yàn)表明，在不同色譜條件下對(duì)苦瓜提取液浸膏進(jìn)行粗分離和進(jìn)一步的細(xì)分離，最后在色譜條件為流動(dòng)相∶石油醚-乙酸乙酯（7∶3）；流速 5 mL/min；檢測(cè)波長280 nm；進(jìn)樣量50 μL時(shí)，從中分離得到2-2號(hào)峰收集到的洗脫液抑菌效果最好，其對(duì)金黃色葡萄球菌有較為明顯的抑制效果，抑菌圈直徑為12 mm，但其對(duì)大腸桿菌卻沒有明顯的抑制效果。分析其原因可能有兩點(diǎn)：第一，在該峰處收集到的抑菌活性物質(zhì)的濃度還沒有達(dá)到抑制大腸桿菌生長的范圍，通過進(jìn)一步增大其濃度進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，仍沒有明顯效果；第二，該活性物質(zhì)可能是與其它類物質(zhì)協(xié)同作用起到抑制的效果，經(jīng)過進(jìn)一步的細(xì)分離之后，其它類物質(zhì)被分離開，從而導(dǎo)致其失去抑制大腸桿菌生長的作用。

總之，運(yùn)用制備型高效液相法對(duì)苦瓜提取液浸膏進(jìn)行分離，分離高效快速，并且通過重復(fù)試驗(yàn)證明該法具有很好的重現(xiàn)性，能夠得到抑菌效果較好的一類物質(zhì)，以便于下一階段對(duì)該類物質(zhì)的性質(zhì)做進(jìn)一步的分析研究。

[1]萬新建,陳學(xué)軍,纓南生.我國苦瓜的研究現(xiàn)狀及展望[J].江南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2002(6):46-50

[2]袁杰,杜琪珍.苦瓜中活性成分的初步研究[J].食品研究開發(fā),2004(1):108-109

[3]向亞林,凌冰,張茂新.苦瓜化學(xué)成分和生物活性的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2005,17(2):242-246

[4]高明哲,袁曉艷,肖紅斌.制備型高效液相色譜法從積雪草提取物中分離純化積雪草甙和羥基積雪草甙對(duì)照品[J].色譜,2008,26(3):362-365

[5]王永祿,王麗瑤.制備型高效液相色譜法及其在中藥研究中的應(yīng)用[J].中醫(yī)藥通報(bào),2006,5(3):60-63

Research on the Antibacterial Activity Components of Momordica Charantia L by Preparative High Performance Liquid Chromatography

MENG Xiao，MA Li*
（School of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China）

The antibacterial activity components of Momordica charantia L.were separated by the preparative high performance liquid chromatography （Pre－HPLC）.The result shows:the best antibacterial activity components were separated under the conditions of the petroleum ether（60 ℃－90 ℃）:ethyl acetate is 7∶3,0.5 mL of injection volume,5 mL/min of velocity,the detection wavelength is 280 nm.The Staphylococcus aureus was inhibited well and the Inhibition zone diameter is 12 mm.

Pre-HPLC;momordica charantia L.;antibacterial

孟曉（1983—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通訊作者

2009-08-13