滇牡丹分類處理的細(xì)胞學(xué)與分子生物學(xué)證據(jù)

孔 紅，成仿云

（1.廊坊師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 廊坊 065000；2.北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，北京100083）

滇牡丹Paeonia delavayi屬于芍藥科Paeoniaceae芍藥屬Paeonia牡丹組（Sect.Moutan）肉質(zhì)花盤亞組（Subsect.Delavayanae）［1］，為中國(guó)西南地區(qū)特有種。主要分布于云南中部至西北部、四川西南部和西藏東南部，是芍藥屬分布最南的一個(gè)牡丹類群，在芍藥屬的起源、演化和地理分布研究上有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值，且滇牡丹擁有黃色花基因，在雜交育種上具有重要應(yīng)用價(jià)值［2］。有關(guān)滇牡丹的研究非常廣泛，而且滇牡丹的分類一直存在爭(zhēng)議，始終是研究的熱點(diǎn)問題。筆者主要就近年來國(guó)內(nèi)外開展的有關(guān)滇牡丹分類的細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)方面的研究進(jìn)行了總結(jié)，目的是指出問題，供今后研究參考。

1 分類簡(jiǎn)史和分類處理

滇牡丹葉裂片數(shù)目、葉裂片寬度、花色、苞片數(shù)量具豐富的多樣性［2］，這些性狀是滇牡丹形態(tài)分類的主要依據(jù)。1886年，F(xiàn)ranchet根據(jù)Delavay采自云南麗江的紫色花標(biāo)本和洱源的黃色花標(biāo)本發(fā)表了滇牡丹和黃牡丹P.lutea Delavay ex Franch.［3］。1904年，F(xiàn)inet和Gngnepain將黃牡丹降為滇牡丹的變種 P.delavayi var.lutea Finet ex Gngnepain［4］。1913年，Rehder和Wilson根據(jù)采自四川康定葉裂片狹窄的標(biāo)本發(fā)表了狹葉牡丹P.delavayi var.angustiloba Rehder et Wilson［5］，而在1921年，Komarov根據(jù)原地采集的標(biāo)本發(fā)表了保氏牡丹P.potanini Komarov［6］。1943年及1946年，Stern分別將Stapt和Stern發(fā)表的金蓮牡丹P.trollioides Stapt ex Stern以及Bean發(fā)表的銀蓮牡丹P.delavayi var.alba Bean處理為保氏牡丹的一個(gè)變種 P.potanini var.trollioides（Stapt ex Stern）Stern［7］和一個(gè)變型 P.potanini f.alba（Bean）Stern［8］。這些類群構(gòu)成了滇牡丹復(fù)合群，以后關(guān)于滇牡丹復(fù)合群的分類一直存在爭(zhēng)議，歸納起來有以下4種觀點(diǎn)：①認(rèn)可3種1變種 1變型［8－11］，即滇牡丹P.delavayi Franch.，黃牡丹P.lutea Delavay ex Franch.，保氏牡丹 P.potanini Komarov，金蓮牡丹 P.potanini var.trollioides（Stapt ex Stern）Stern，銀蓮牡丹 P.potanini f.alba（Bean）Stern；②認(rèn)可 2種 1變種［12］，即滇牡丹 P.delavayi Franch.，黃牡丹 P.lutea Delavay ex Franch，狹葉牡丹 P.delavayi var.angustiloba Rehder et Wilson；③認(rèn)可 1 種 2 變種［13－14］，即滇牡丹 P.delavayi Franch.，黃牡丹 P.delavayi var.lutea Finet ex Gngnepain，狹葉牡丹 P.delavayi var.angustiloba Rehder et Wilson；④將滇牡丹復(fù)合群歸并為1個(gè)種，即滇牡丹P.delavayi Franch.，理由是這一類群在居群內(nèi)花色的變化從白色、純黃色、黃色有紫紅色斑塊、橙色、紅色至紅紫色；花瓣數(shù)目4～10枚，花絲和花藥顏色從黃色變至橙色、紫紅色；心皮數(shù)目2～5或3～6個(gè)，顏色綠色至紫紅色；葉裂片數(shù)68～312片，葉裂片寬度為0.40～2.86 cm；苞片1～5片；萼片2～5，或4～6，或7～9片，綠色至紫紅色；花盤綠色、黃色、紅色或紫紅色。另外，這個(gè)類群一致地兼有性生殖和無性繁殖，根紡錘狀加粗。沒有一個(gè)性狀或性狀的組合可以把它劃分為不同種甚至種下分類群［1，15］。這一觀點(diǎn)得到一些研究者的贊同［2，16－26］，并廣泛開展了細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)方面的研究。

2 細(xì)胞學(xué)證據(jù)

2.1 染色體核型

染色體是基因的載體，是生物進(jìn)化發(fā)育、遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)。染色體核型是植物體細(xì)胞染色體所有可測(cè)定的表型特征的總稱，主要指染色體數(shù)目和形態(tài)特征［27］。

滇牡丹的染色體基數(shù)x=5，染色體數(shù)目2n=2x=10，為二倍體，屬大型染色體［28－30］。關(guān)于滇牡丹的核型分析研究報(bào)道較多［28－31］，核型的主要特征歸納于表1［2，32］。龔洵等［2］認(rèn)為，滇牡丹 12 個(gè)居群中出現(xiàn)了8種核型。核型的差異不僅表現(xiàn)在不同染色體類型數(shù)目上，而且表現(xiàn)在隨體的數(shù)目（0～6）和位置上，以及次縊痕的數(shù)目（0～5）和位置上，這種核型的多樣性反映出了滇牡丹居群水平上的遺傳多樣性。這與牡丹組所有種的染色體核型沒有明顯差異的結(jié)論［33－34］不太一致。李懋學(xué)等［35］報(bào)道，牡丹染色體的隨體屬于微型隨體，在牡丹同一種或同一品種中，不同作者報(bào)道的隨體數(shù)目不一致的現(xiàn)象常見。另外，Ag-Nor數(shù)普遍多于常規(guī)染色可見到的隨體數(shù)目，表明常規(guī)染色所見的隨體數(shù)目并不是一個(gè)穩(wěn)定可靠的核型特征。滇牡丹的染色體隨體很?。?8－30］，同樣存在以上問題，隨體數(shù)目和位置差異很不可靠。因此，僅憑隨體的有無及數(shù)目進(jìn)行種及種下類群的核型結(jié)構(gòu)比較是很難的。

由表1可知，滇牡丹核型由中部著絲點(diǎn)染色體（m），近中部著絲點(diǎn)染色體（sm）和近端部著絲點(diǎn)染色體（st）等3種染色體類型組成。根據(jù)染色體類型的數(shù)目不同，滇牡丹不同居群的核型可分為3種：①2n=10=6m+2sm+2st，②2n=10=7m+1sm+2st，③2n=10=5m+2sm+3st。其中 10個(gè)滇牡丹居群屬于核型①，為Stebbins［36］核型分類的 2A型［28－30］，只有祿勸居群、麗江魯?shù)榫尤喝旧w類型的數(shù)目略有不同，表明滇牡丹復(fù)合群核型基本一致。

2.2 染色體帶型

肖調(diào)江等［31］對(duì)滇牡丹復(fù)合群5個(gè)類群的Giemsa C-帶進(jìn)行了全面研究，龔洵等［32］對(duì)滇牡丹黃色花類型8個(gè)居群的Giemsa C-帶進(jìn)行了研究，結(jié)果表明所有染色體都在著絲點(diǎn)附近顯示出了Giemsa C-帶，長(zhǎng)臂上沒有顯帶，只有短臂上的Giemsa C-帶的數(shù)量和位置表現(xiàn)了一定的差異?？梢姷崮档じ骶尤宏P(guān)系非常密切，可能由同一祖先演化而來，短臂上Giemsa C-帶的差異說明了各居群分別對(duì)其生態(tài)環(huán)境形成了適應(yīng)性而產(chǎn)生了遺傳分化［2］。

3 分子生物學(xué)證據(jù)

于玲等［37］對(duì)滇牡丹復(fù)合群中的黃牡丹和狹葉牡丹葉片蛋白譜帶進(jìn)行了相似性定量分析，結(jié)果表明兩者之間蛋白譜帶排序間距較小，具有較近的親緣關(guān)系。鄒喻蘋等［38］對(duì)滇牡丹復(fù)合群中的紫牡丹和黃牡丹進(jìn)行了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD，random amplified polymorphic DNA）分析，結(jié)果表明兩者遺傳距離很近，親緣關(guān)系緊密，可看作同一種的2個(gè)居群。對(duì)滇牡丹進(jìn)行分子標(biāo)記最全面的報(bào)道是楊淑達(dá)等［18］應(yīng)用簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（ISSR，inter-simplesequencerepeat）標(biāo)記對(duì)滇牡丹的遺傳多樣性開展的研究，結(jié)果表明，滇牡丹在分子水平上遺傳多樣性水平較高，居群間表現(xiàn)出一定的遺傳分化。非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA，unweighted pair-group method with arithmetic means）聚類分析結(jié)果完全支持Hong等［1］對(duì)滇牡丹的分類處理。

表1 12個(gè)滇牡丹居群的核型Table 1 Karyotype of 12 population of Paeonia delavayi

近年來，基因序列分析開始用于滇牡丹的研究中。Sang 等［39－41］，F(xiàn)erguson 等［24］，Tank 等［26］，趙宣等［22］分別對(duì)滇牡丹的2個(gè)居群（滇牡丹復(fù)合群中的P.delavayi和P.lutea）進(jìn)行了核糖體DNA的ITS序列、葉綠體matK基因、乙醇脫氫酶基因、GPAT基因序列分析，結(jié)果表明兩者親緣關(guān)系很近。但遺憾的是，上述研究中只涉及了滇牡丹的2個(gè)居群，代表性有限，因此還需要加強(qiáng)滇牡丹不同居群基因序列的研究，為滇牡丹復(fù)合群合并為滇牡丹一個(gè)種提供更全面的分子依據(jù)。

4 討論

滇牡丹分類研究經(jīng)歷了100多年的發(fā)展，從形態(tài)分類開始，到逐漸開展的染色體核型、Giemsa C-帶、分子標(biāo)記及基因測(cè)序，逐漸證明了滇牡丹復(fù)合群合并為滇牡丹一個(gè)種的合理性，但滇牡丹基因測(cè)序所取材料代表性有限，染色體銀染帶及原位雜交等研究尚屬空白，還有待進(jìn)一步研究。將染色體核型、Giemsa C-帶、銀染帶、染色體原位雜交、分子標(biāo)記及基因測(cè)序等研究相結(jié)合，可為滇牡丹復(fù)合群合并為滇牡丹1個(gè)種提供充分的科學(xué)依據(jù)。滇牡丹種內(nèi)形態(tài)變異很大，因此，洪德元等［1，15］認(rèn)為滇牡丹不宜劃分任何種下類型。由于滇牡丹復(fù)合群中P.delavayi和P.lutea等不同居群在引種中表現(xiàn)出實(shí)生后代的遺傳穩(wěn)定性以及花色素組成上的顯著差異等，李嘉玨［42］對(duì)滇牡丹復(fù)合群的完全合并而沒有任何種下類群的處理持有保留意見。Haw［25］贊同滇牡丹復(fù)合群歸并為滇牡丹1個(gè)種，并在種下設(shè)了2個(gè)變種5個(gè)變型，但這一種下等級(jí)的處理未見被采用。滇牡丹是否應(yīng)建立種下類群，還有待于進(jìn)一步研究和探討。

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