結(jié)締組織生長因子與肝纖維化的研究進展

肖緒華綜述,趙永忠審校

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,廣西桂林541001)

結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種間質(zhì)細胞的生長因子,具有明顯的絲裂原性和趨化性,可以啟動一系列介導(dǎo)組織創(chuàng)傷修復(fù)和再生的生物學(xué)過程。作為轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factorβ1,TGF-β1)的下游反應(yīng)元件,CTGF 介導(dǎo) TGF-β 1 促組織纖維化的效應(yīng),而與TGF-β1抗炎、調(diào)節(jié)免疫等其他生物學(xué)效應(yīng)無明顯相關(guān),因此可能成為抗肝纖維化的更具特異性的靶點,在探索抗纖維化的道路上愈來愈引起大家的關(guān)注。本文就CTGF與肝纖維化的研究進展綜述如下。

1 CTGF概述

CTGF最早是在人臍靜脈內(nèi)皮細胞的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的,它屬于一種即刻早期基因(CTGF Cyr61 Nov,CCN)家族成員之一?，F(xiàn)已證明 CTGF基因位于第 6號染色體長臂(6q 23.1),相對分子量為 36 000～38 000,含 349個氨基酸殘基,是一種C端富含半胱氨酸肝素結(jié)合蛋白的分泌性多肽,廣泛表達于人類心臟、胎盤、肺、肝臟及腎臟等多種組織器官中。大量研究表明,CTGF可由多種類型的細胞產(chǎn)生,如胚胎組織、皮膚、腎小球系膜細胞、腎間質(zhì)細胞、肝及胰腺星狀細胞、血管內(nèi)皮及平滑肌細胞,表達量取決于組織細胞類型及功能狀態(tài)。事實上,CTGF是TGF-β生物學(xué)作用的下游效應(yīng)介質(zhì),它在功能上與TGF-β具有很大的相似性,包括具有有絲分裂原效應(yīng),促使細胞增殖;促進細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成,抑制其降解,導(dǎo)致ECM的積聚及結(jié)構(gòu)改建;表達細胞黏附因子使細胞易黏附和結(jié)合基質(zhì)蛋白;具有趨化效應(yīng),在體外能趨化成纖維樣細胞,而這些效應(yīng)都與纖維化密切相關(guān)。相對TGF-β,CTGF的最大特點就是生物學(xué)功能比較單一,主要表現(xiàn)在對纖維化的影響[1]。另外,在對 TGF-β應(yīng)答時CTGF可以調(diào)控關(guān)鍵的細胞事件,包括遷移、增殖、基質(zhì)產(chǎn)生和成纖維細胞收縮、分化成肌成纖維細胞,這些都是纖維化應(yīng)答事件[2]。說明CTGF是重要的促組織纖維化蛋白,在組織纖維化的形成和發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。

2 CTGF在肝纖維化組織中的表達和作用

CTGF在正常肝組織中的表達很少,僅在間質(zhì)和肝血管有少量的表達[3]。但在肝纖維化動物模型肝組織及慢性肝病患者肝組織中CTGF mRNA和蛋白質(zhì)表達水平增高,并與肝纖維化程度成正相關(guān)。Li等[4]運用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法發(fā)現(xiàn),四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型組與對照組相比,CTGF蛋白和基因表達明顯增強。Hsu等[5]采用二甲基亞硝胺(DMA)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給予DMA 2～5周后大鼠肝組織中TGF-β1和CTGF mRNA高表達,表達水平隨著肝纖維化程度積分的增加而逐漸升高。Abou-Shady等[6]用Northern印跡雜交(Northern blot)分析顯示,慢性病毒性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)、原因不明的肝病和酒精性肝病等患者的硬化肝臟中CTGF和TGF-β1 mRNA的表達水平與正常人肝臟相比增加了6～8倍。Horac等[7]研究發(fā)現(xiàn)在伴有肝臟脂肪變和纖維化的慢性丙型肝炎患者組織中CTGF的表達明顯增強,并認(rèn)為CTGF是獨立的致肝纖維化因子。Kobayashi等[8]對膽管閉鎖患者手術(shù)切除活檢標(biāo)本進行了原位雜交檢測發(fā)現(xiàn),在膽管閉鎖患者肝組織中CTGF mRNA表達增高,特別是在肝細胞和星狀肝細胞(HSC)中表達明顯,而且表達與病變程度相關(guān)?？梢娫诼愿尾』颊呒案卫w維化動物模型肝組織中,CTGF mRNA和蛋白質(zhì)表達水平增高,程度與肝纖維化積分成正相關(guān),但與肝纖維化的類型無關(guān)。

研究表明,在肝組織中CTGF的主要來源于HSC。Paradis等[9]檢測了原代培養(yǎng) 3 d(靜止?fàn)顟B(tài))、5 d(中間狀態(tài))和 7 d(活化狀態(tài))HSC的CTGF mRNA水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達隨時間進行性上調(diào),同時Ⅰ型膠原mRNA的表達在第3天和第5天上調(diào)了近12倍,而且Ⅰ型膠原mRNA的表達增長相對滯后。結(jié)果證明HSC不僅能分泌CTGF而且提示CTGF可能對膠原基因表達具有調(diào)控作用。Gressner等[10]在培養(yǎng)的HSC和肝細胞兩種細胞系分別測定CTGF和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-SM A在激活HSC中表達升高,而CTGF表達不依賴于細胞激活轉(zhuǎn)化;并同時發(fā)現(xiàn)在被激活的肝細胞中CTGF強烈表達,說明肝細胞也可能參與了CTGF表達。在體內(nèi)實驗中,Tong等[11]通過將人CTGF基因轉(zhuǎn)到大鼠體內(nèi),使其表達CTGF基因和蛋白,通過與非轉(zhuǎn)基因大鼠比較發(fā)現(xiàn),單純的CTGF高表達并不能導(dǎo)致肝功能和肝組織學(xué)變化。但在給予CCl4以后,轉(zhuǎn)基因大鼠無論是血清透明質(zhì)酸水平還是肝組織中α-SM A、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MM P-2)和金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)的mRNA表達水平較對照組明顯升高。轉(zhuǎn)基因大鼠在膽總管結(jié)扎2周后也表現(xiàn)出了大量的膠原蛋白沉積。說明體內(nèi)CTGF水平升高不會導(dǎo)致肝損傷或纖維化本身,而是呈現(xiàn)出肝臟更容易受其他致纖維化因素所傷害。這可能是由于CTGF與其他分子如 TGF-β1、纖維連接蛋白相互影響,對這些因子信號傳導(dǎo)起協(xié)同和放大的作用,CTGF的高表達改變了肝組織的微環(huán)境,增加了肝臟對損傷刺激的敏感性。這支持了CTGF在肝纖維化形成過程中的核心作用。

總之,激活的HSC可產(chǎn)生CTGF,而CTGF又可促進成纖維細胞的增殖、遷移、黏附和ECM的產(chǎn)生,誘導(dǎo)纖維化的產(chǎn)生[12]。CTGF還可能是多種纖維化信號通路下游的共同效應(yīng)因子,在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用,因此被稱為肝臟疾病中扳動纖維化產(chǎn)生的“總開關(guān)”[13]。

3 CTGF與肝纖維化的診斷

肝纖維化主要靠肝組織穿刺活檢診斷,但由于這是一種侵入性檢查而且費用高,因而限制了其廣泛使用,尋找一種良好的肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)具有很大的實用價值。大量研究表明CTGF在正常肝組織中僅有少量表達,在肝纖維化時CTGF表達升高且與肝纖維化程度相關(guān)。因由體內(nèi)細胞產(chǎn)生的CTGF可以直接分泌到細胞外間隙,并進入體循環(huán),因此使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血液中CTGF濃度被認(rèn)為是一種診斷和評估纖維化程度的一個良好指標(biāo)[14]。Kovalenko等[15]對138例丙型病毒性肝炎患者和129例慢性肝病患者血清CTGF水平進行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙型病毒性肝炎患者和慢性肝病患者血清CTGF水平較正常人明顯增高,而且CTGF水平與肝纖維化程度和肝硬化分級有關(guān);且同時發(fā)現(xiàn)CTGF存在多種基因型。Gressner等[16]采用多層免疫分析法檢測了83例慢性肝病患者(包括17例慢性肝炎患者,16例組織學(xué)診斷為肝纖維化患者,50例肝硬化患者)和74例健康人的血清CTGF濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),慢性肝炎組、肝纖維化組和肝硬化組的血清CTGF濃度分別是健康對照組的4.3倍、5.2倍和3.2倍,說明了CTGF與肝纖維化有關(guān);并發(fā)現(xiàn)硬化組的CTGF水平較纖維化組低,認(rèn)為CTGF濃度反映的是纖維化發(fā)展的程度,并非組織硬化程度,因此可作為進展期肝纖維化程度的指標(biāo)。Zhang等[17]也做了類似的研究,而且對患者的肝纖維化程度進行了詳細的分級,用ELISA檢測血清CTGF濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),健康人和慢性肝炎患者間、不同級別肝纖維化患者之間,CTGF濃度逐漸升高;說明CTGF的濃度不僅與肝纖維化相關(guān)而且隨著肝纖維化程度的加重而升高,提示CTGF可能是診斷和反映肝纖維化程度的良好標(biāo)志物。

4 干擾CTGF表達與肝纖維化的基因治療

CTGF作為 TGF-β的下游介質(zhì),是一個比 TGF-β更具特異性的靶位。因此,針對CTGF的治療策略受到廣泛的關(guān)注。多項研究表明,針對CTGF轉(zhuǎn)錄水平的干擾可能是一種有效的抗肝纖維化的治療方法。Zhu等[18]將能在體內(nèi)自主合成短發(fā)夾狀RNA(shRNA)的pEGFP-CTGF表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HSCT6(一種鼠源性激活的HSC株),觀察其對CTGF mRNA及蛋白表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染 pEGFP-CTGF shRNA1的HSC-T6細胞CTGF的表達被干擾,顯著減少Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原、層黏蛋白(LN)和透明質(zhì)酸(HA)的形成。Li等[19]在HSC培養(yǎng)基中加入抗CTGF的小分子干擾RNA(siRNA),發(fā)現(xiàn)在HSC培養(yǎng)基中抗CTGF的 siRNA高效特異的抑制了CTGF的基因表達,同時發(fā)現(xiàn)α-SMA表達顯著降低。在激活的HSC中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的mRNA的表達及上清液中HA濃度均降低。說明siRNA能有效和特異性下調(diào)大鼠HSC的CTGF的表達,顯著抑制HSC的活化和增殖并能有效抑制細胞外基質(zhì)生產(chǎn),應(yīng)用siRNA抑制CTGF基因表達可能是抗肝纖維化治療的一種有效的策略。同時發(fā)現(xiàn)在加入siRNA大鼠原代HSC培養(yǎng)7 d(激活期)后,觀察到HSC G0/G1時相細胞比例明顯增多,表明siRNA沉默CTGF可能是通過誘導(dǎo)細胞周期靜止來抑制大鼠HSC增殖。誘導(dǎo)細胞周期靜止可能是siRNA沉默CTGF抑制大鼠HSC增殖的機制之一。

在體內(nèi)實驗中,Uchio等[20]用CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的發(fā)生,以反義核苷酸對HSC的CTGF進行RNA干擾,可減少CTGF、TGF-β和Ⅰ型膠原mRNA的表達,而 TIM P-1和纖維沉積的量沒有改變。說明單純降低CTGF的水平雖可抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,但由于TIMP-1的持續(xù)高表達,干擾CTGF表達抗纖維化治療的效果受到影響。Li等[4]應(yīng)用門靜脈注射CTGF siRNA的方法對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型進行治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA治療組Ⅰ、Ⅲ型膠原,LN、TIMP-1和TGF-β1的基因表達均減弱,活化的 HSC數(shù)量減少,α-SMA表達降低 ,血清中Ⅲ型前膠原、肝羥脯氨酸與肝纖維化程度均降低。George和Tsutsumi[21]發(fā)現(xiàn)在二甲基亞硝胺(DMA)所致的肝纖維化模型中,應(yīng)用CTGF siRNA治療后CTGF以及TGF-β1基因表達減弱,HSC的活化受抑制,肝臟中結(jié)締組織沉積減少。結(jié)果表明CTGF siRNA可以有效的預(yù)防和治療DMA所致的大鼠肝纖維化。

總之,沉默或干擾CTGF基因表達的方法在體內(nèi)外實驗中均表現(xiàn)出強烈而且特異的抑制ECM沉積的作用,抗CTGF的基因治療做為一種嶄新的抗纖維化手段,給抗纖維化治療帶來了新的思路,具有廣闊的應(yīng)用前景。

5 展 望

CTGF是調(diào)控器官纖維化的重要細胞因子,不僅直接調(diào)節(jié)HSC的活化和ECM的產(chǎn)生,而且可能是纖維化信號通路下游的共同效應(yīng)因子,在多種組織器官纖維化中起關(guān)鍵作用。另外,CTGF生物學(xué)作用比其上游控件TGF-β1更單一,主要局限在纖維化的發(fā)生方面。抑制CTGF表達的治療比抗TGF-β1更具針對性,而不影響 TGF-β1的抗炎、免疫抑制等重要生理作用。進一步深入研究CTGF的基因表達調(diào)控、信號傳導(dǎo)通路及致纖維化機制,將有助于探索更特異更有效的抗纖維化治療策略,為控制纖維化疾病帶來嶄新希望,具有重要的臨床意義。

[1]Kobayashi H,Hayashi N,Hayashi K,et al.Connective tissue growth factor and progressive fibrosis in biliary atresia[J].Pediatr Surg Int,2005,21(1):12.

[2]Secker GA,Shortt AJ,Sampson E,et al.TGFbeta stimulated re-epithelialisation is regulated by CTGF and Ras/M EK/ERK signaling[J].Exp Cell Res,2008,314(1):131.

[3]Friederichsen S,Heuer H,Christ S,et al.Gene expression of connective tissue growth factor in adult mouse[J].Growth Factors,2005,23(1):43.

[4]Li G,Xie Q,Shi Y,et al.Inhibition of connective tissue growth factor by siRNA prevents liver fibrosis in rats[J].J Gene Med,2006,8(7):889.

[5]Hsu YC,Chiu YT,Lee CY,et al.Increases in fibrosis-related gene transcripts in livers of dimethylnitrosamine-intoxicated rats[J].J Biomed Sci,2004,11(3):408.

[6]Abou-Shady M,Friess H,Zimmermann A,et al.Connective tissue growth factor in human liver cirrhosis[J].Liver,2000,20(4):296.

[7]Hora C,Negro F,Leandro G,el al.Connective tissue growth factor,steatosis and fibrosis in patients with chronic hepatitis C[J].Liver Int,2008,28(3):370.

[8]Kobayashi H,Hayashi N,Hayashi K,el al.Connective tissue growth factor and progressive fibrosis in biliary atresia[J].Pediatr Surg Int,2005,21(1):12.

[9]Paradis V,Dargere D,Bonvoust F,et al.Effects and regulation of connective tissue growth factor on hepatic stellate cells[J].Lab Invest,2002,82(6):767.

[10]Gressner OA,Lahme B,Demirci I,et al.Differential effects of TGF-beta on connective tissue growth factor(CTGF/CCN2)expression in hepatic stellate cells and hepatocytes[J].J Hepatol,2007,47(5):699.

[11]Tong Z,Chen R,Alt DS,et al.Susceptibility to liver fibrosis in mice expressing a connective tissue growth factor transgene in hepatocytes[J].Hepatology,2009,50(3):939.

[12]Higashiyama H,Yoshimoto D,Kaise T,et al.Inhibition of activin receptor-like kinase 5 attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].Exp Mol Pathol,2007,83(1):39.

[13]Gressner OA,Gressner AM.Connective tissue growth factor:a fibrogenic master switch in fibrotic liver diseases[J].Liver Int,2008,28(8):1065.

[14]Leask A,Parapuram SK,Shi-Wen X,et al.Connective tissue growth factor(CTGF,CCN2)gene regulation:a potent clinical bio-marker of fibroproliferative disease?[J].J Cell Commun Signal,2009,3(2):89.

[15]Kovalenko E,Tacke F,Gressner OA,et al.Validation of connective tissue growth factor(CTGF/CCN2)and its gene polymorphisms as noninvasive biomarkers for the assessment of liver fibrosis[J].J Viral Hepat,2009,16(9):612.

[16]Gressner AM,Yagmur E,Lahme B,et al.Connective tissue growth factor in serum as a new candidate test for assessment of hepatic fibrosis[J].Clin Chem,2006,52(9):1815.

[17]Zhang D,Wang NY,Yang CB,et al.The clinical value of serum connective tissue growth factor in the assessment of liver fibrosis[J].Dig Dis Sci,2010,55(3):767.

[18]Zhu YH,Ren WH,Shi J,et al.Disruption of connective tissue growth factor by short hairpin RNA inhibits collagen synthesis and extracellular matrix secretion in hepatic stellate cells[J].Liver Int,2008,28(5):632.

[19]Li G,Li D,Xie Q,et al.RNA interfering connective tissue growth factor prevents rat hepatic stellate cell activation and extracellular matrix production[J].J Gene Med,2008,10(9):1039.

[20]Uchio K,Graham M,Dean NM,et al.Down-regulation of connective tissue growth factor and typeⅠcollagen mRNA expression by connective tissue growth factor antisense oligonucleotide during experimental liver fibrosis[J].Wound Repair Regen,2004,12(1):60.

[21]George J,Tsutsumi M.siRNA-mediated knockdown of connective tissue growth factor prevents N-nitrosodimethylamine-induced hepatic fibrosis in rats[J].Gene Ther,2007,14(10):790.