蒼耳氯仿萃取物對粘蟲的拒食作用及酶活性的影響

熊正燕，周 瓊，蘇 旭

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院，中國 長沙 410004；2. 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國 長沙 410081)

蒼耳 (XanthiumsibiricumPatrin) 為菊科蒼耳屬 (XanthiumL .) 一年生草本植物，在我國各地均有分布．據(jù)報道，蒼耳子可用于治療多種疾病，并且具有一定程度的抑菌活性[1]．對蒼耳化學(xué)防御成分的系統(tǒng)研究結(jié)果顯示，蒼耳提取物對小菜蛾等多種害蟲有生物活性[2-3]，其不同溶劑提取物對害蟲具有很強的拒食活性，其中，氯仿提取物的活性最高[4]．在此基礎(chǔ)上，作者進一步研究了蒼耳氯仿萃取物對昆蟲的拒食活性以及對昆蟲中腸消化酶和血淋巴酯酶活性的影響，為蒼耳活性次生物質(zhì)對害蟲作用機理的研究提供實驗依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

粘蟲(Pseudaletiaseparatawalker)由國家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心湖南基地提供，用玉米苗在養(yǎng)蟲室內(nèi)續(xù)代飼養(yǎng)，室溫 (25±1)℃，60%～70% RH，測試時選取大小相近的健康幼蟲供試．

蒼耳采自湖南省湘潭市市郊．將采回的新鮮蒼耳沖洗凈塵土，晾干，50 ℃恒溫烘干至脆，用植物試樣粉碎機粉碎，過0.4 mm篩．粉末放置于4 ℃冰箱中保存．

1.2 方法

1.2.1 蒼耳氯仿萃取物的制備 稱取蒼耳粉末，用5倍于粉末重量的甲醇在恒溫水浴箱 (80 ℃) 中索氏提取器內(nèi)回流24 h，倒出提取液，過濾，濾液濃縮至一定濃度，然后用氯仿萃取多次，萃取物濃縮至膏狀，裝于棕色瓶中，貼上標(biāo)簽，放于4 ℃冰箱中保存，測試前臨時稀釋．

1.2.2 選擇性拒食活性的測定 拒食活性測定方法參照周瓊[5]等方法，用蒸餾水將蒼耳氯仿萃取物(稀釋前先用丙酮溶解成1 g/mL)配成所需濃度的溶液，測試濃度根據(jù)前期測試結(jié)果，并參照張宗炳[6](1988)設(shè)定，分別為：0.025、0.05、0.1、0.25、0.5 g/mL．取玉米葉片中脈兩側(cè)的部分，裁成20 mm×20 mm的正方形，在配制好的測試液中浸漬2 s，取出待溶劑自然揮發(fā)，對照葉在相應(yīng)量丙酮加蒸餾水中浸漬2 s，自然晾干．將2枚處理葉和2枚對照葉交錯排列，放置在墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿(Φ120 mm)中，每皿中處理組和對照組均為1枚正面朝上，1枚背面朝上．每皿接入1頭粘蟲4齡幼蟲，測試前饑餓3 h，25 ℃飼養(yǎng)，測試期間及時添加相應(yīng)處理后的玉米葉．24 h后將蟲剔除，用透明方格紙測量取食面積．每濃度設(shè)10重復(fù)．

1.2.3酶活性的測定 用浸漬葉片法將濃度0.01 g/mL的蒼耳氯仿萃取物處理的玉米葉飼喂試蟲，分別取喂食后12 h和24 h存活的粘蟲四齡幼蟲供試．

1.2.3.1 中腸酶活性測定方法 每試取10頭存活幼蟲，將試蟲在冰浴中迅速解剖，用預(yù)熱的0.15 mol/L NaCl溶液沖去體液，用鑷子抽取中腸，除去內(nèi)含物，冰凍勻漿，離心15 min(11 200 r/min，4 ℃)，取上清液定容至10 mL(即1 mL/中腸)．冰凍貯存(-20 ℃)；蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[7]，以酪蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；參照陳長琨(1993)方法測定羧酸酯酶活性，以α-萘酚含量和OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]；采用二硝基水楊酸法[9]測定中腸淀粉酶活性；采用福林-酚法[10]測定蛋白酶活性．用umol/(mg蛋白質(zhì)*min)表示酶比活力．每組重復(fù)3次．

1.2.3.2 血淋巴酯酶活性測定方法 試蟲用蒸餾水洗凈，刺破腹足，用2 mL離心管收集血淋巴，加入苯基硫脲(約占總體積的0.5%)防止氧化，置于-20 ℃冰箱中保存，保存不超過4 d；蛋白質(zhì)含量與羧酸酯酶活性測試方法同上．每組重復(fù)3次．

1.3 實驗數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析．

選擇性拒食率=〔 ( 對照組取食面積-處理組取食面積 ) / ( 對照組取食面積+處理組取食面積 ) 〕× 100%

參照賈春生的方法[11]求回歸方程，計算拒食中濃度(AFC50)．

酶活性抑制率=﹝(對照組酶比活力-處理組酶比活力)/ 對照組酶比活力﹞×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 蒼耳氯仿萃取物對粘蟲的拒食作用

喂食后24 h，對幼蟲取食葉片的面積進行統(tǒng)計分析．結(jié)果表明，氯仿萃取物對粘蟲四齡幼蟲的取食有明顯影響，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，在所測試的濃度范圍，隨處理濃度增加，對粘蟲的拒食活性增強，其拒食中濃度(AFC50)為0.038 g/mL(如表1)．

表1 蒼耳氯仿萃取物對粘蟲四齡幼蟲的選擇性拒食率(24 h)

**差異極顯著．

2.2 蒼耳氯仿萃取物對粘蟲中腸消化酶活性的影響

2.2.1 蒼耳氯仿萃取物對粘蟲中腸蛋白酶活性的影響 分別于喂食后12 h和24 h取出10頭幼蟲進行蛋白質(zhì)含量和蛋白酶活性測試．結(jié)果顯示(圖1)，處理組粘蟲中腸蛋白酶比活力明顯低于對照(P<0.05)：喂食后12 h，蛋白酶活性抑制率為39.4%；喂食后24 h，蛋白酶活性抑制率高達(dá)67.9%．

2.2.2 蒼耳氯仿萃取物對粘蟲中腸淀粉酶活性的影響 用經(jīng)氯仿萃取物處理后的玉米葉片飼養(yǎng)粘蟲四齡幼蟲后，測試粘蟲淀粉酶活性結(jié)果顯示(圖2)，處理組粘蟲中腸淀粉酶比活力明顯受到抑制：喂食后12 h，淀粉酶活力受到的抑制率為27.1%；喂食后24 h，抑制率達(dá)到58.3%．

圖1 蒼耳氯仿萃取物對粘蟲幼蟲中腸蛋白酶活性的影響 圖2 蒼耳氯仿萃取物對粘蟲幼蟲中腸淀粉酶活性的影響

2.2.3 氯仿萃取物對粘蟲中腸羧酸酯酶(CarE)活性的影響 喂食后12 h，粘蟲中腸CarE比活力與對照組相近，這可能與粘蟲取食有毒物質(zhì)較少有關(guān)，喂食后24 h，粘蟲中腸CarE受到明顯抑制，活性降低，活性抑制率為31.28%．

2.3 氯仿萃取物對粘蟲血淋巴羧酸酯酶(CarE)活性的影響

以0.01g/mL的蒼耳氯仿萃取物飼養(yǎng)粘蟲四齡幼蟲，然后對其體內(nèi)羧酸酯酶活性進行了測定．結(jié)果顯示(圖4)，喂食后12 h，粘蟲血淋巴CarE活性則顯著低于對照(P<0.05)；喂食后24 h，血淋巴CarE活性則明顯高于對照(P<0.05)．

圖3 蒼耳氯仿萃取物對粘蟲幼蟲中腸羧酸酯酶活性的影響 圖4 蒼耳氯仿萃取物對粘蟲幼蟲血淋巴羧酸酯酶活性的影響

3 討論

蒼耳氯仿萃取物對粘蟲四齡幼蟲的拒食作用和對粘蟲中腸消化酶活性的影響結(jié)果表明，蒼耳氯仿萃取物中含有拒斥粘蟲取食的物質(zhì)．

蛋白酶和淀粉酶是昆蟲體內(nèi)重要的消化酶[12]，影響著昆蟲對食物的消化和吸收利用．昆蟲中腸是消化酶分泌的主要場所，消化酶活性的變化反映了生長發(fā)育的需要[13]．本研究結(jié)果表明，用氯仿萃取物處理粘蟲四齡幼蟲，能引起中腸淀粉酶、蛋白酶和酯酶活性發(fā)生改變，隨處理時間的延長，對3種消化酶活性的抑制作用增強，具體表現(xiàn)為：在喂食后24 h時，粘蟲中腸蛋白酶和淀粉酶活性受到的抑制率幾乎是喂食后12 h活性抑制率的2倍；同時，在喂食后12 h，處理組粘蟲中腸羧酸酯酶活性只略微降低，與對照組差異不顯著，到24 h后明顯降低且與對照差異顯著，說明蒼耳氯仿萃取物中含有能明顯抑制粘蟲幼蟲中腸消化酶活性的物質(zhì)，并且隨時間的延長和粘蟲取食量的增加抑制效果增強．根據(jù)以上分析，作者認(rèn)為蒼耳氯仿萃取物對粘蟲四齡幼蟲消化酶活性的抑制，可能是影響其取食的重要因素之一.

羧酸酯酶(CarE)又是昆蟲體內(nèi)的一種代謝解毒酶，是昆蟲進行殺蟲劑代謝的重要解毒酶系，有研究表明，植物次生物質(zhì)可誘導(dǎo)激活或抑制害蟲體內(nèi)與殺蟲劑代謝相關(guān)的解毒酶系，從而導(dǎo)致害蟲對藥劑敏感性的變化[14]．粘蟲血淋巴中羧酸酯酶活性的表現(xiàn)與中腸羧酸酯酶活性的表現(xiàn)不同，處理后12 h時明顯低于對照，24 h又明顯高于對照，這可能與昆蟲血淋巴內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的利用和解毒活性相關(guān)，中腸酯酶活性被粘蟲所取食的含有蒼耳氯仿提取物的食物抑制，而該活性物質(zhì)進入血淋巴后，先抑制血淋巴中的羧酸酯酶活性，同時，該物質(zhì)還誘導(dǎo)粘蟲產(chǎn)生保護性的解毒反應(yīng)，進而激活血淋巴羧酸酯酶活性升高．

植物次生物質(zhì)以多種方式影響昆蟲和其他草食性動物，如劇毒、致畸、干擾激素以及影響食物的消耗和利用[15]等．本研究顯示蒼耳氯仿萃取物可明顯抑制粘蟲幼蟲中腸消化酶活性，并誘導(dǎo)激活該蟲血淋巴羧酸酯酶活性，已有的研究[16-17]表明，從蒼耳乙酸乙酯萃取物和氯仿萃取物中分離出的倍半萜內(nèi)酯類和甾醇類物質(zhì)是蒼耳的重要活性次生物質(zhì)，有關(guān)其對昆蟲的行為、生理生化和生長發(fā)育等影響以及昆蟲的行為化學(xué)感受機制等研究工作仍在進行中，以期為昆蟲與植物相互關(guān)系的研究和害蟲的綜合治理提供有益的線索．

參考文獻(xiàn)：

[1] 張君霞. 十五種植物提取物抑菌活性的初步研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2003, 12(2): 122-124.

[2] 周 瓊, 梁廣文, 曾 玲. 幾種植物提取物和藥劑對桃蚜和蘿卜蚜生長發(fā)育的影響[J]. 中國蔬菜, 2005，(2): 15-17.

[3] 周 瓊, 劉炳榮, 舒迎花, 等. 蒼耳等藥用植物提取物對小菜蛾的拒食作用和產(chǎn)卵忌避效果[J]. 中國蔬菜, 2006，(2): 17-20.

[4] 張君霞, 張新虎, 楊小華. 蒼耳不同溶劑提取物對粘蟲和蚜蟲的殺蟲活性研究[J]. 西北師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2006, 42(3): 82-85.

[5] 周 瓊, 魏美才, 劉炳榮,等. 蒼耳不同分離物對害蟲的拒食和忌避活性[J]. 植物保護, 2007, 33(6): 81-85.

[6] 張宗炳. 殺蟲藥劑的毒力測定(原理、方法、應(yīng)用)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1988.

[7] BRADFORD M M . A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye bingding [J]. Anal Biochem, 1976, 7(72)：248-254.

[8] 陳長琨. 昆蟲生理生化實驗[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 1993.

[9] BLACKBUN M, GOLUBEVA E, BOWEN D,etal. A novel insecticidal toxin from Photorhabdus luminescens, Toxin complex a (Tca), and its histopathological effects on the midgut of Manduca sexta [J]. Appl Environ Microbiol, 1998, 64: 3 036-3 041.

[10] 周景祥, 王桂芹, 余 濤. 蛋白酶和淀粉酶活性檢測方法探討[J]. 中國飼料, 2001, (11)：23-24.

[11] 賈春生. 利用SPSS 軟件計算殺蟲劑的LC50[J]. 昆蟲知識, 2006, 43(3): 414-417.

[12] 師光祿, 王有年, 王鴻雷, 等. 萬壽菊根提取物對山楂葉螨谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和蛋白酶及蛋白質(zhì)含量的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2007, 18(2): 400-404.

[13] 唐慶峰,吳振廷, 金 濤, 等. 中華真地鱉中腸主要消化酶的活性研究[J]. 昆蟲知識, 2005, 42(5): 557-561.

[14] BRATTSTEN L B. Potential role of plant allelochemical in the development of insecticide resistance [C]//BARBOSA P，LETOURNEAU D K. Novel Aspects of Insect-plant Interaction. New York: Wiley, 1998：313-348.

[15] LINDROTH R L. Differential toxicity of plant allelochemicals to insects: roles of enzymatic detoxication systems[J]. Insect-Plant Interactions, 1991，(3): 1-33.

[16] 周 瓊，魏美才，歐曉明，等. 蒼耳活性組分對害蟲的拒食和忌避作用及其化學(xué)成分[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報，2009，18(1)：74-79.

[17] 周 瓊，魏美才，歐曉明，等. 蒼耳倍半萜內(nèi)酯和博落回生物堿對3種蔬菜害蟲的活性比較[J]. 植物保護，2008, 24(3):78-82.