老年性白內障合并2型糖尿病患者晶狀體上皮細胞轉化生長因子β表達及其與晚期糖基化終末產物的相關性△

羅怡 吳繼紅 張圣海 徐萍 盧奕

·臨床研究·

老年性白內障合并2型糖尿病患者晶狀體上皮細胞轉化生長因子β表達及其與晚期糖基化終末產物的相關性△

羅怡 吳繼紅 張圣海 徐萍 盧奕

目的研究轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)在老年性白內障合并2型糖尿病患者中的表達變化及其可能的作用機制,為進一步闡明老年性白內障合并2型糖尿病患者發(fā)病的分子機制提供實驗數(shù)據(jù)。方法分別采用點雜交和實時熒光聚合酶鏈反應方法定量檢測和分析老年性白內障患者及老年性白內障合并2型糖尿病患者晶狀體前囊膜上皮細胞中TGF-β蛋白、mRNA表達水平。免疫熒光方法觀察晚期糖基化終末產物(advanced glycation endoproducts，AGEs)對體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞TGF-β表達的影響。結果與老年性白內障患者相比，老年性白內障合并2型糖尿病患者晶狀體前囊膜上皮細胞中TGF-β(TGF-β1/2/3)蛋白表達增加(Plt;0.05)，mRNA表達變化分別為TGF-β1升高(Plt;0.05)，TGF-β2降低(Plt;0.01)，TGF-β3未見顯著改變(Pgt;0.05)。AGEs與晶狀體上皮細胞共培養(yǎng)后，細胞表面TGF-β(TGF-β1/2/3)表達上調。結論TGF-β在老年性白內障合并2型糖尿病患者晶狀體上皮細胞中的表達上調。AEGs可誘導晶狀體上皮細胞TGF-β表達上調。(中國眼耳鼻喉科雜志，2010，10：212-214)

糖尿?。?白內障； 晶狀體上皮細胞； 轉化生長因子β； 晚期糖基化終末產物

轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)可調節(jié)晶狀體上皮細胞的增殖和分泌，因而在老年性和后發(fā)性白內障形成過程中起了重要作用。但TGF-β是否參與老年性白內障合并2型糖尿病患者白內障的發(fā)生及其可能的作用機制，國內外尚罕見報道。本實驗采用細胞學和分子生物學技術，研究老年性白內障合并2型糖尿病患者晶狀體上皮細胞TGF-β蛋白及mRNA的表達水平，初步探討TGF-β表達變化與晚期糖基化終末產物(advanced glycation endoproducts，AGEs)的相關性，為全面闡明老年性白內障合并2型糖尿病患者發(fā)病的分子機制提供實驗數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 選取2007年12月至2008年3月期間我科收治的老年性白內障合并2型糖尿病患者48例(經內科明確診斷為2型糖尿病,病史5年以上)，其中男性20例，女性28例；年齡60～82歲，平均(70.2±10.0)歲。老年性白內障患者54例，其中男性20例， 女性34例；年齡54～80歲，平均(69.4±12.0)歲。術前排除青光眼、眼底視網膜脫離、葡萄膜炎、眼外傷等病變或其他內眼手術史。糖尿病患者術前血糖均穩(wěn)定在8.2 mmol/L以下，老年性白內障患者術前血糖為4.3～6.1 mmol/L，平均(5.2±0.9)mmol/L。全身檢查無特殊病變。

1.2 樣本采集 兩組分別經我科行常規(guī)白內障超聲乳化人工晶狀體植入手術取晶狀體前囊膜：術中用撕囊鑷行前囊膜環(huán)形撕囊，所得前囊膜大小為5～7 mm，立即置入去RNase酶的EP管中，-80 ℃保存待用。

1.3 晶狀體前囊膜TGF-β蛋白表達的檢測 晶狀體前囊膜經組織裂解液裂解后，抽取蛋白，加熱變性。分別取2 μL上述蛋白樣品滴加在硝酸-纖維素膜上，室溫晾干。5%牛血清白蛋白封閉20 min后，一抗(Neomark, 1∶200)室溫孵育30 min。TBS/T漂洗3次，加入二抗(Invitrogen, 1∶500)室溫孵育30 min。最后以ECL化學發(fā)光劑(Thermo公司)孵育1 min，X線膠片曝光、顯影、定影。將5例前囊膜標本合并為一個樣本。每組5個樣本，每個樣本重復實驗2～3次。采用ImagePro 軟件進行密度灰度值定量分析。

1.4 晶狀體前囊膜TGF-β亞型mRNA表達的定量分析 采用RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)分別制備兩組患者的晶狀體前囊膜總RNA。以β-actin作為內參，所有待測樣本均做復孔，實時熒光聚合酶鏈反應(ABI 7000，ABI公司，美國)檢測TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種亞型的mRNA表達。擴增條件：95 ℃ 2 min預變性，然后按94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。引物序列見表1。各個樣本不同指標的定量結果均用相應的β-actin定量結果標化。

表1 轉化生長因子β1/2/3基因上下游引物序列

注：TGF-β為轉化生長因子β

1.5 人晶狀體上皮細胞(lens epithelial cell, LEC)培養(yǎng)及AGEs干預 本研究所采用的人LEC為美國ATCC公司產品。采用補充了10%胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Gibco公司，美國)。預先將無菌的小玻片放置在24孔細胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，分別按每孔2×105將LEC細胞接種在小玻片上，24 h后細胞貼壁。將終濃度為1、5、10 mg/mL的AGEs加入到LEC細胞的培養(yǎng)液中，隔天加1次。7 d后取出小玻片，以4%多聚甲醛固定20 min，用于免疫熒光檢測。

1.6 LEC細胞TGF-β表達的觀察 以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.4)漂洗固定在小玻片的LEC細胞；加入磷酸鹽緩沖液稀釋的一抗TGF-β(NeoMarker公司，1∶200)，37 ℃孵育2 h；磷酸鹽緩沖液漂洗細胞3次，加入熒光二抗(Invitrogen公司，1∶500)，37 ℃孵育50 min；磷酸鹽緩沖液漂洗后加入DAPI孵育5 min，套染細胞核；Mowvil封片，正置熒光顯微鏡(Leica公司，德國)觀察熒光表達。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),單因素方差分析比較組間差異,以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

老年性白內障合并2型糖尿病患者LEC中TGF-β的點狀范圍均較老年性白內障患者的大，背景清晰(見附1頁圖①)。TGF-β在老年性白內障合并2型糖尿病患者LEC中的表達高于老年性白內障 (Plt;0.05)。TGF-β1 mRNA 在老年性白內障合并2型糖尿病患者LEC內的表達高于老年性白內障，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)；TGF-β2 mRNA表達則低于老年性白內障(Plt;0.01)；TGF-β3 mRNA在LEC表面的表達峰度高，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)，詳見表2和附1頁圖②。不同濃度的AGEs與人LEC共培養(yǎng)7 d后，TGF-β紅色熒光均較正常對照組增強(附1頁圖③)。

表2 轉化生長因子β三種亞型mRNA在兩組患者晶狀體上皮細胞中的表達(pg/mL)

3 討 論

糖尿病性白內障發(fā)病的分子生物學機制至今仍不明確。越來越多的研究表明，AGEs在老年性白內障合并2型糖尿病的發(fā)生中起著關鍵作用[1]。然而AGEs如何介導以前囊膜下或后囊膜下纖維混濁為主要病變特點的老年性白內障合并2型糖尿病患者白內障的發(fā)生，目前國內外尚罕見報道。本實驗通過對臨床標本的分析發(fā)現(xiàn)，老年性白內障合并2型糖尿病患者LEC中TGF-β表達較老年性白內障患者顯著上調，其中mRNA表達上調以TGF-β1為主。體外研究進一步發(fā)現(xiàn)，AGEs可誘導LEC中TGF-β表達。這些結果提示，AGEs可能通過誘導LEC中TGF-β的表達而參與老年性白內障合并2型糖尿病患者白內障的發(fā)生。

TGF-β有5種亞型,即TGF-β1～β5。 其中TGF-β1～β3存在于哺乳動物中,TGF-β1和TGF-β2蛋白及其mRNA表達于絕大多數(shù)眼組織，TGF-β3僅表達于晶狀體上皮組織和纖維，房水和玻璃體中無表達，LEC中同時表達有3種TGF-β亞型的受體[2]。 TGF-β通過對LEC的影響，在后發(fā)性白內障的形成中起了重要作用，此外在老年性核性和皮質性白內障的LEC中，TGF-β的含量不同，導致兩者的發(fā)病機制和病理改變不完全相同[3-5]。Liu等[6]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的大鼠晶狀體中加入TGF-β能誘導前囊膜下白內障的發(fā)生。小鼠晶狀體纖維細胞中活性TGF-β過度表達也引起前囊膜下白內障[7]。Mcavoy等[2]認為TGF-β能通過促進LEC間質化來誘導白內障。Lee和Joo[8]的實驗表明,在前極性白內障的LEC中TGF-β的表達顯著增加,并分析為TGF-β通過增強纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、平滑肌肌動蛋白的mRNA表達而發(fā)揮作用。由此可見，TGF-β通過調節(jié)LEC的增殖和分泌在各種類型白內障的發(fā)病中起了重要作用。筆者[9]曾報道TGF-β在老年性白內障合并2型糖尿病患者的前房液中含量的改變。本實驗以老年性白內障作為對照，發(fā)現(xiàn)老年性白內障合并2型糖尿病患者LEC中TGF-β蛋白表達增加，同時通過體外實驗探討了TGF-β表達上調的機制與AGEs有關，兩者可能是老年性白內障合并2型糖尿病患者發(fā)病機制分子鏈中的重要環(huán)節(jié)。

本實驗發(fā)現(xiàn)TGF-β2的mRNA在老年性白內障合并2型糖尿病患者前囊膜中表達較老年性白內障者低。TGF-β2具有雙向功能:一方面對于胚胎層的細胞具有加速分裂增殖,另一方面又具有抑制細胞的作用。TGF-β2可通過調節(jié)LEC增殖狀態(tài),從而在白內障發(fā)生過程中起重要作用。有研究[10-11]表明，老年核性白內障組LEC中TGF-β2 mRNA的水平低于老年皮質性白內障組。老年核性白內障的發(fā)生與LEC增殖有關,而皮質性白內障的發(fā)生與LEC的退行性變有關。本實驗結果提示：白內障合并2型糖尿病患者的晶狀體TGF-β2 mRNA表達下降，LEC的增殖抑制作用減弱，與老年核性白內障相似。

本實驗探討AGEs、TGF-β與老年性白內障合并2型糖尿病患者發(fā)生的內在相互聯(lián)系。在今后的實驗中可深入研究老年性白內障合并2型糖尿病患者中TGF-β各亞型的表達變化及與AGEs的關系，為全面闡明老年性白內障合并2型糖尿病患者的分子發(fā)病機制提供新的思路和數(shù)據(jù)。

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(本文編輯 諸靜英)

試題7.答案：B。UGH綜合征多發(fā)生于前房型人工晶狀體，也可見于后房型人工晶狀體。其原因為人工晶狀體或晶狀體襻與虹膜及房角不斷摩擦，從而引起頑固性葡萄膜炎、反復出血和繼發(fā)性青光眼。

Expressionoftransforminggrowthfactor-βinlensepithelialcellsofdiabeticcataractanditsrelationshipwithadvancedglycationendoproducts

LUOYi,WUJi-hong,ZHANGSheng-hai,XUPing,LUYi.

DepartmentofOphthalmology,EyeEarNoseandThroatHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China

LU Yi,Email:luyi_eent@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of transforming growth factor-β(TGF-β) in the lens epithelial cells of diabetic cataract.MethodsAnterior capsule lens epithelial cells from the diabetic cataract patients and age-related cataract patients were extracted to detect TGF-β protein and mRNA expression by using dot blot and real-time polymerase chain reaction respectively. Observation of TGF-β expression of the lens epithelial cells after coculture of TGF-β and AGEs was done by method of immunofluorescence staining.ResultsProtein expression of TGF-β in the anterior capsule lens epithelial cells in the diabetic cataract significantly increased, compared to that in the age-related cataract. Regarding the mRNA expressions of the three subtypes of TGF-β, TGF-β1 mRNA expression increased(Plt;0.05), TGF-β2 mRNA decreased(Plt;0.01), and no significant change in TGF-β3 mRNA(Pgt;0.05) was found. TGF-β expression of lens epithelial cells enhanced after coculture with AGEs.ConclusionsThe expression of TGF-β in the lens epithelial cells of diabetic cataract significantly increased in comparison with the age-related cataract. The enhancement of TGF-β expression in the cultured lens epithelial cells was induced by AGEs. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2010,10:212-214)

Diabetes mellitus; Cataract; Lens epithelial cell; Transforming growth factor-β; Advanced glycation endoproducts

上海市科技發(fā)展基金資助項目(08495801700)

復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031

盧奕(Email:luyi_eent@yahoo.com.cn)

2010-01-18)