烏龜缺氧潛水呼吸的耐受性及巴西龜血液生理生化特性的研究

詹 球，高 軍，李 燁，胡 慧，朱澤瑞，印大中

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點實驗室，中國 長沙 410081)

龜類是世界上最長壽的動物之一，龜?shù)拈L壽可能與它抵御各種惡劣環(huán)境傷害的潛能有關(guān)[1-2]．淡水龜類的抗缺氧生存能力極強，尤其是它的大腦[2-3]．例如，巴西龜(Trachemysscripta)在3 ℃下缺氧潛水能存活約44 d[4]，美國錦龜(Chrysemyspicta)在同等溫度下缺氧潛水的存活時間可長達5個月[5]．外界環(huán)境對龜類的缺氧潛水生存起著決定性作用．其中，溫度的影響最為明顯．Jackson的研究表明：淡水龜在3℃下缺氧潛水90 d仍可恢復(fù)正常,但當(dāng)水溫上升至20 ℃時，潛水僅12 h后就無法恢復(fù)正常[6]．而龜類在不同水溫下缺氧潛水時單位時間耗氧量和缺氧耐受極限及其變化規(guī)律迄今未見報道．

目前在探索龜類抗缺氧生存的分子機理方面已做了初步研究，其機理可概括為3點：(1)龜在缺氧時的能量代謝率大幅度降低，減少了能量消耗[3]；(2)龜體內(nèi)有一套特殊的酸堿平衡機制，能夠緩解甚至避免因厭氧代謝終產(chǎn)物—乳酸的積累所造成的酸中毒現(xiàn)象[7]；(3)龜體內(nèi)儲存了豐富的糖原，能在缺氧時為機體提供能量[3]．但前人未對龜類在缺氧潛水時與能量代謝相關(guān)的生化指標進行深入的研究，例如對與能量代謝相關(guān)的酶類的研究．

本實驗的目的是通過研究烏龜缺氧潛水的耐受極限和潛水不同時段巴西龜血液的生理生化指標，探索龜類缺氧潛水時生理生化變化以及這些變化與龜類長壽所具有的相關(guān)性．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 烏龜(Geoclemys reevesii)由湖南四進生物股份有限公司(衡陽市)提供；巴西龜(Trachemys scripta)購買于長沙市西長街楊記水產(chǎn)總部．于實驗室內(nèi)自然條件下培養(yǎng)，篩選出10只3周歲體重350 g左右的健康烏龜和12只3周歲體重1 200 g左右的健康巴西龜，實驗前一個星期開始禁食．

1.1.2 器材和設(shè)備 CL-8000 日本津島自動生化分析儀；AVL COMPACT3血氣分析儀(瑞士)；康樂電熱恒溫水浴箱；CONTEC AV2000數(shù)字視頻腦電地形圖(美國)；TD5A-WS低速臺式離心機；2 mL一次性無菌注射器；真空抽血器(7號)等．

1.2 方法

1.2.1 烏龜缺氧潛水呼吸實驗裝置(圖1) 將烏龜置于容器的底層(網(wǎng)孔隔板以下)，注滿水，容器蓋用凡士林密封，用3個鐵夾子分三方夾緊容器蓋接合面，防止漏氣；測定前用氬氣將容器內(nèi)的空氣排干凈，待容器內(nèi)外壓力平衡時，關(guān)閉氣壓平衡閥．使烏龜?shù)暮难鮾H來源于容器中7 L自來水溶解的氧．用虹吸法經(jīng)1號管取水樣，定時檢測水樣溶氧量．巴西龜缺氧潛水呼吸的實驗裝置與圖1一致．

圖1 烏龜缺氧潛水呼吸的裝置示意圖

1.2.2 水中溶氧量的測定方法 采用經(jīng)典的化學(xué)碘量法．在水樣中加入硫酸錳和堿性碘化鉀，生成的氫氧化錳迅速與水中溶氧生成錳酸錳．高價錳在強酸性條件下氧化碘離子成為I2．以淀粉為指示劑，用1 mol/L Na2S2O3標準溶液滴定，根據(jù)消耗Na2S2O3標準溶液的體積來計算水中溶氧量(CDO)．

CDO=8C標準溶液V標準溶液/V水樣×1 000，

式中：CDO為水樣溶氧量(mg/L)；C標準溶液為Na2S2O3標準溶液的濃度(mol/L)；V標準溶液為消耗Na2S2O3標準溶液的體積(mL)；V水樣為水樣體積(mL)；系數(shù)8為O2相對分子質(zhì)量/4.

每次測試取300 mL水樣，分3次滴定，結(jié)果取平均值．

1.2.3 判斷烏龜死亡的方法 1)通過水樣溶氧量的變化進行初步判斷，如相鄰兩個測試時間點所測得的水樣溶氧量基本相同，則初步判定烏龜死亡．2)通過檢測烏龜?shù)哪X電活動證明死亡.將初步判定已死亡的烏龜從裝置中取出，檢測腦電信號．當(dāng)腦電圖呈現(xiàn)典型的空白波，則表明烏龜死亡．

1.2.4 巴西龜頸動脈取血方法 將巴西龜背部朝下固定于手術(shù)臺上，沿豎直方向剪開頸部右側(cè)皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉，剝離頸動脈．抽取約1 mL血液后，針尖立刻插入小橡皮塞內(nèi)，隔絕空氣防止血液氧化，即刻進行血氣指標檢測(24 ℃，5 min以內(nèi))．同時，從頸動脈抽取約4 mL血液置于真空貯血管中進行生化測定．

1.2.5 血液生化指標 將巴西龜?shù)娜糜?7 ℃下恒溫水浴30 min，以3 000 r/min離心5 min，分離血清．用全自動生化分析儀檢測血清的生化指標(儀器設(shè)置溫度：37 ℃)．

1.2.6 血氣指標的測定方法 用血氣分析儀檢測血氣指標(儀器設(shè)置溫度：37 ℃)．

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對烏龜潛水呼吸的影響

將經(jīng)過逐漸降溫鍛煉的3只(5只凍死2只)烏龜和逐漸升溫鍛煉的5只烏龜分別置于4 ℃冰箱和30 ℃溫箱中培養(yǎng)10 d，然后分別置于4 ℃和30 ℃水中進行12 h缺氧潛水實驗，定時測定水中溶氧量和單位時間耗氧量．發(fā)現(xiàn)30 ℃下水中溶氧量的下降速率比4 ℃下快得多(圖2A)，且30 ℃下烏龜每分鐘的耗氧量(平均數(shù)：0.033 9 mg/min)比4 ℃下(平均數(shù)：0.013 7 mg/min)高得多(圖2B)．

圖2 4 ℃和30 ℃下烏龜缺氧潛水時水中溶氧量(A)和單位時間耗氧量(B)隨潛水時間的變化

將30 ℃和4 ℃下各時間點所測得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，分析結(jié)果見表1.

表1 30 ℃與4 ℃條件下烏龜缺氧潛水時水中溶氧量和單位時間耗氧量平均數(shù)t值比較

表1說明,兩種溫度處理比較，水中溶氧量的下降速率差異達到高度顯著水平，t=-95.035 3***,P<0.001；烏龜單位時間耗氧量差異達到極顯著水平，t=3.201 9**，P<0.01．

這說明,在0～30 ℃條件下水溫越高，烏龜單位時間耗氧量越大，水中溶氧量的下降速度越快．因此，在本實驗供氧受限的環(huán)境下，烏龜?shù)纳鏁r間會隨著水溫的升高而縮短．反之，水溫越低，烏龜缺氧潛水的生存時間會越長．

2.2 缺氧烏龜潛水的極限狀態(tài)

將3只烏龜置于30 ℃水中進行缺氧潛水實驗，直至死亡．定時測定水中溶氧量及單位時間耗氧量，探索烏龜缺氧潛水的生存極限．得平均數(shù)結(jié)果如圖3．

A.水中溶氧量隨潛水時間的變化 B.烏龜單位時間單位體重平均耗氧量隨潛水時間的變化圖3 烏龜缺氧潛水的生存極限(水溫30 ℃)

從圖3可知，烏龜在30 ℃、7 L水中缺氧呼吸時，3只烏龜平均存活時間為：(30±1.15) h；水中溶氧量隨著潛水時間的延長而降低(Y=-0.201 4X+7.601 1，P<0.01)，當(dāng)溶氧量降低至(1.458±0.028) mg/L時，烏龜?shù)纳E象基本消失．

2.3 巴西龜缺氧潛水時，血液的生理生化指標分析

由于烏龜個體小，頸動脈太細，血流速度慢，采血十分困難，而巴西龜個體大，頸動脈較粗，采血較為容易．經(jīng)預(yù)實驗結(jié)果顯示烏龜和巴西龜在潛水前后的血液指標基本一致，且巴西龜?shù)目谷毖跄芰Ω鼜?，它能?0 ℃、7 L水中存活約40 h．因此，本研究選用巴西龜在缺氧潛水時的血液生化指標為代表來觀察和研究龜類與抗缺氧生存相關(guān)的分子機理．

預(yù)備實驗結(jié)果表明，巴西龜潛水10 h、20 h后四肢及頭部仍可有力地收縮；而40 h后全身肌肉松弛，頭部自然下垂，四肢癱軟，生命跡象微弱．說明缺氧潛水40 h時，巴西龜?shù)哪偷脱醭潭纫堰_到極限，機體正處于極度缺氧狀態(tài)．

2.3.1 巴西龜缺氧潛水時血液生化指標和血氣指標的統(tǒng)計結(jié)果 用全自動生化分析儀和血氣分析儀測定巴西龜缺氧潛水0(對照)，10，20，40 h時的生化指標和血氣指標(共12只巴西龜:4個處理,每個處理3個重復(fù))．結(jié)果列于表2.

表2 巴西龜潛水前(0 h)，潛水10，20，40 h血液生化指標和血氣指標的方差分析(體重：(1 246.9±175.1)g)

續(xù)上表

分析指標x±s.d.0 h10 h20 h40 hF值人體參考值[Cl-]/(mmol·L-1)96.73±10.3797.63±3.7887.1±2.6260.4±26.681.15897～110[K+]/(mmol·L-1)6.80±1.426.46±1.425.26±0.107.46±0.700.6033.5～5.5[Na+]/(mmol·L-1)136.90±6.12139.10±6.45130.3±4.10129.7±5.723.367135～145[Ca2+]/(mmol·L-1)1.38D±0.031.99C±0.162.70B±0.243.55A±0.2521.000**1.1～1.4[Ca]/(mmol·L-1)2.75D±0.073.99C±0.315.41B±0.497.10A±0.5021.000**2.1～2.9[P]/(mmol·L-1)2.88±0.343.01±0.563.30±0.203.17±0.170.2360.8～1.7[BGlu]/(mmol·L-1)5.83C±2.5123.31B±1.9326.2B±2.4040.1A±1.9730.317**3.9～6.1[BUN]/(mmol·L-1)6.68±3.1523.02±16.196.14±0.662.68±0.381.3882.5～7.1[CR]/(μmol·L-1)14.27±6.8123.17±1.0729.6±15.3625.9±16.740.67344～133[UA]/(μmol·L-1)405.77±223.35426.50±79.50516.2±94.77410.3±117.250.12090～420ρ(TP)/(g·L-1)63.43±1.8253.11±5.1253.8±2.4849.9±7.251.68960～80ρ(ALB)/(g·L-1)28.96±0.7922.17±2.5622.51±0.9323.10±5.961.01735～55ρ(GLB)/(g·L-1)34.44±1.5730.93±3.0531.36±2.3826.83±2.681.88120～30ρ(ALB)/ρ(GLB)0.85±0.040.71±0.060.72±0.060.87±0.210.5261.5～2.5ρ(BMG)/(mg·L-1)0.17±0.020.79±0.290.30±0.170.29±0.163.0391.0～3.0ρ(APOA)/(g·L-1)0.31±0.300.05±0.030.04±0.030.04±0.030.9601.0～1.6ρ(APOB)/(g·L-1)0.04±0.030.00±0.000.06±0.050.03±0.031.0480.6～1.1[CHOL]/(mmol·L-1)5.72±2.143.69±0.254.13±0.844.98±1.360.7213.2～5.7[TG]/(mmol·L-1)3.25±2.082.37±0.665.55±1.489.13±0.474.2770.6～1.7[HDL]/(mmol·L-1)2.00±0.931.10±0.221.17±0.241.04±0.070.6981.1～2.0[LDL]/(mmol·L-1)2.11±0.861.38±0.132.08±0.521.83±0.940.3671.6～3.1[TB]/(μmol·L-1)5.76±2.925.17±2.581.81±0.351.87±0.432.0505.10～17.1[DB]/(μmol·L-1)1.71±0.691.49±0.360.44±0.140.65±0.172.6110.0～6.0[IB]/(μmol·L-1)4.05±2.333.68±2.481.37±0.431.23±0.271.4250.0～15血液pH值7.19A±0.036.84B±0.056.66C±0.036.52D±0.04151.504**7.35～7.45P(CO2)/kPa10.97C±0.9017.17B±1.5623.07A±0.3123.00A±0.2441.907**4.65～6.00P(O2)/kPa24.06A±3.622.16B±0.291.68B±0.171.86B±0.3635.701**9.97～13.30標準F值F3,6,0.05=4.757; F3,6,0.01=9.780

注：巴西龜缺氧潛水前(0 h)，潛水10，20，40 h時的水中溶氧量分別為：(8.13±1.97)，(6.40±1.06)，(5.05±1.17)，(2.27±0.05)mg/L．

方差分析表明,血液指標：巴西龜血清中肌酸激酶、堿性磷酸酶、鎂離子、鈣離子、總鈣和葡萄糖6項生化指標的差異達到極顯著水平(P<0.01)；肌酸激酶同工酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、膽堿酯酶3項生化指標的差異達到顯著水平(P<0.05)．血氣指標：血液pH值、二氧化碳分壓和血氧分壓3項血氣指標差異達到極顯著水平(P<0.01)．

2.3.2 巴西龜缺氧潛水時血液生化指標和血氣指標平均數(shù)的多重比較 將以上有差異的血液生化指標和血氣指標(共12項指標)進行平均數(shù)多重比較，分析結(jié)果如圖4～6．

從表2、圖4A可知,對照組血清中肌酸激酶、肌酸激酶同工酶和乳酸脫氫酶的活性極高,分別為(61 876.37A±2 487.34)，(5 238.60c±313.15)，(17 603.27±8 817.63)μmol·min-1·L-1，高達人體的幾百倍或幾十倍．當(dāng)巴西龜缺氧潛水時，肌酸激酶活性急劇下降至(18 891.10B±4 939.95)μmol·min-1·L-1，處理組與對照組比較差異均達到極顯著水平(P<0.01)；乳酸脫氫酶活性也下降，但未達到顯著水平(P>0.05)；肌酸激酶同工酶活性隨著缺氧潛水時間延長而大幅度升高，從(5 238.60c±313.15)μmol·min-1·L-1上升至(19 593.17a±3 047.37)μmol·min-1·L-1，其中潛水40 h與對照組比較差異極顯著(P<0.01)，潛水20 h與對照組比較差異顯著(P<0.05)，而潛水10 h與對照組比較差異不顯著(P>0.05). 以上數(shù)據(jù)表明，無論處于什么生理狀態(tài)龜血都含有活性極高的與能量代謝相關(guān)的酶，這些酶通過肌酸磷酸去磷酸化或糖酵解途徑提供能量．在缺氧潛水初期，肌酸激酶活性大幅度降低，后期趨于平緩；而肌酸激酶同工酶活性卻持續(xù)升高．

圖4 巴西龜缺氧潛水0 h、10 h、20 h、40 h時部分酶活性的變化

從圖4B可知，谷草轉(zhuǎn)氨酶活性在潛水20 h內(nèi)極顯著地降低(P<0.01)，至40 h又顯著地升高(P<0.05)；堿性磷酸酶活性在3個處理時間點上都極顯著地降低(P<0.01)；膽堿酯酶活性在20 h內(nèi)顯著地降低(P<0.05)，到40 h又極顯著地升高(P<0.01)．

圖5 巴西龜缺氧潛水0 h、10 h、20 h、40 h時血糖濃度和鈣、鎂離子濃度的變化

從圖5A可知，對照組血糖濃度較低，為(5.83C±2.51)mmol/L．當(dāng)缺氧潛水時，血糖濃度大幅度升高至(40.1A±1.97)mmol/L，處理與對照比較差異均達到極顯著水平(P<0.01)，但處理間的差異未達到顯著水平(P>0.05)．這說明缺氧巴西龜潛水初期，糖原大量分解成葡萄糖，釋放到血液中．而后該過程仍然持續(xù)，但血糖含量基本維持在恒定的高水平．

從圖5B可知，鎂離子、鈣離子和總鈣濃度處理比對照均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)地升高．

圖6 巴西龜缺氧潛水0，10，20，40 h時血氣指標的變化

從表2、圖6A可知，正常時龜血的氧分壓和二氧化碳分壓約為人的2倍．當(dāng)缺氧潛水時，處理組的血氧分壓均極顯著(P<0.01)地降低，二氧化碳分壓顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)地升高．

從表2、圖6B可知，對照組血液pH值較正常人血稍低，約為7.2．當(dāng)巴西龜缺氧潛水時，血液pH值均極顯著(P<0.01)地降低．

3 討論

3.1 溫度對烏龜缺氧潛水呼吸的影響

溫度對烏龜缺氧潛水呼吸有極顯著的影響，隨著水溫降低，烏龜單位時間耗氧量減少，缺氧存活時間延長，這與國外的研究一致．低溫能引發(fā)一系列抗低氧生存的生理機能變化，如心肌收縮減弱，血氧親合力增強等[8-9]．冬眠是烏龜應(yīng)對自然條件下低溫逆境的最佳應(yīng)激措施，冬眠時，烏龜機體代謝極度抑制，能量消耗維持最低水平，這有利于適應(yīng)惡劣環(huán)境，節(jié)約能量，延長壽命．

3.2 烏龜缺氧潛水的生存極限

大多數(shù)魚類生存的水環(huán)境溶氧量不能低于4 mg/L，蝦、蟹、螺絲不能低于3 mg/L[10]，而烏龜在30 ℃、7 L水中能缺氧生存30 h,當(dāng)水中溶氧量降至1.5～2 mg/L時，烏龜仍然能以約0.001 mg/(g·h)的微弱呼吸維持生命3～4 h．這說明烏龜具有極強的抗缺氧生存能力和特殊的抗低氧應(yīng)激機制．本實驗結(jié)果表明：烏龜缺氧潛水呼吸的單位時間耗氧量隨著水中溶氧量的減少呈現(xiàn)較大的波動．這種根據(jù)水中溶氧量主動或被動調(diào)節(jié)機體代謝水平的機理尚不清楚，有待于進一步研究．本實驗室的相關(guān)研究還表明[11]，烏龜缺氧潛水時可通過非肺呼吸途徑從水中獲取氧．咽部、泄殖腔和皮膚都可以是烏龜重要的呼吸器官，甚至連龜殼也能進行水下氣體交換．

3.3 巴西龜缺氧潛水的能量代謝機制

隨著缺氧潛水時間的延長，巴西龜血清中肌酸激酶的活性降低，而肌酸激酶同工酶的活性升高，提示在缺氧狀態(tài)下巴西龜體內(nèi)存在著獨特的能量代謝機制．同正常的人體血清比較(表2)，肌酸激酶和肌酸激酶同工酶比人體高出上百倍，乳酸脫氫酶比人體高出幾十倍．人體中這些酶類均屬于細胞內(nèi)酶，在血清中測得的活性較低[12]，而巴西龜血清中這些酶類的活性如此強，暗示除三羧酸循環(huán)外，巴西龜還可能存在其它的循環(huán)供能途徑．這條途徑可能是組織中的肌酸磷酸通過去磷酸化產(chǎn)生肌酸和ATP，由肌酸分解產(chǎn)生的肌酐在極高活性的肌酸激酶催化下再次合成肌酸磷酸，儲存于組織內(nèi)．巴西龜這種能重復(fù)利用代謝廢物，將其轉(zhuǎn)化為能量物質(zhì)的機能可能是其在禁食半年之后仍能存活的主要原因之一．但這種可能的循環(huán)途徑以及含有高活性酶的龜血能否運用于運動生理、服務(wù)于運動員，還需要進一步研究．

潛水初期，肌酸激酶活性大幅度降低，可能是由于巴西龜處于從有氧代謝為主逐漸過渡為厭氧代謝為主的狀態(tài)，機體代謝水平仍較高，能量供不應(yīng)求，血清中高活性的肌酸激酶能高效催化生化反應(yīng)，提供能量；肌酸激酶同工酶活性升高可能反映了巴西龜特異的抗缺氧生存的生理優(yōu)勢．

巴西龜缺氧潛水時，血糖含量升高，說明當(dāng)氧供應(yīng)不足時，龜體內(nèi)豐富的肝糖原被大量降解為葡萄糖，釋放到血液中，以補償機體各組織器官缺氧時的能量供應(yīng)不足．

3.4 巴西龜體內(nèi)獨特的離子平衡與緩沖系統(tǒng)

3.5 巴西龜缺氧潛水的氧分壓和二氧化碳分壓

血氣指標檢測發(fā)現(xiàn)，巴西龜缺氧潛水時的血氧分壓約為人體的2倍(見表2)，暗示巴西龜紅細胞的攜氧能力可約為人的2倍，表明巴西龜?shù)募t細胞結(jié)構(gòu)比人體更加優(yōu)越，或者龜類的血紅蛋白較人類具有較多的氧結(jié)合位點，從而使紅細胞與血氧的親和力增強，使巴西龜即使在低氧環(huán)境中也能有效地捕獲氧．此外，從二氧化碳分壓和氧分壓的數(shù)據(jù)推測，巴西龜潛水初期的能量代謝方式可能處于過渡轉(zhuǎn)變階段，隨著缺氧呼吸時間延長，機體代謝方式逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐詤捬醮x為主．

綜上所述，龜類具有極強的抗低氧生存潛能，低溫有利于龜類的抗缺氧存活；血清中極高活性的肌酸激酶和乳酸脫氫酶等可能是龜類長壽、抗饑餓和抗缺氧能力強的重要分子基礎(chǔ)；缺氧時肌酸激酶活性降低而同工酶活性以及血糖含量升高提示龜類在逆境中可能具有特殊的能量代謝平衡和抗氧化應(yīng)激機制；缺氧時鈣、鎂離子濃度升高暗示著龜類具有獨特的酸堿平衡體系．這些結(jié)果為運動醫(yī)學(xué)研究和抗衰老醫(yī)學(xué)相關(guān)的生理生化探索提供了有價值的參考．

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