硫辛酸對甲醛致人HepG2細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用

陳建明，李耀平，張國偉，邱 明

(杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

甲醛(formaldehyde，F(xiàn)A)是常見工業(yè)毒物,也是居室中的常見空氣污染物，被廣泛應(yīng)用于建筑、裝飾材料和家用化學(xué)品等方面.甲醛的生物毒性涉及多個(gè)方面,包括遺傳毒性和致癌作用等，不同濃度甲醛可以誘導(dǎo)多種類型細(xì)胞發(fā)生突變，包括點(diǎn)突變、DNA鏈斷裂、DNA-DNA及DNA-蛋白質(zhì)分子交聯(lián)等，甲醛對人群健康的危害已成為社會(huì)和公眾關(guān)注的熱點(diǎn)[1-2].因此，尋找對甲醛誘發(fā)細(xì)胞DNA損傷有保護(hù)作用的物質(zhì)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義.硫辛酸(lipoic acid)是一種廣泛性的抗氧化劑，在細(xì)胞保護(hù)、清除自由基、抗氧化等方面具有重要的作用[3].在人體內(nèi)，硫辛酸是一種輔酶，它與碳水化合物的氧化利用有關(guān)，線粒體生產(chǎn)過程中必不可少，硫辛酸在線粒體內(nèi)被降解為二氫硫辛酸時(shí)其抗氧化功能更強(qiáng)[4].中國對硫辛酸的研究不多,該研究利用可以快速靈敏檢測出細(xì)胞DNA損傷的彗星試驗(yàn)(comet assay)探討硫辛酸對甲醛誘發(fā)的人HepG2細(xì)胞DNA損傷是否有保護(hù)作用.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料

硫辛酸(碧云天生物公司，S0075)，低熔點(diǎn)瓊脂糖(BIO Basic公司，AB0015)，正常熔點(diǎn)瓊脂糖(BIO Basic公司，AB0013)，溴化乙錠(上海生工，E0492)，0.4%苔盼藍(lán)(碧云天生物公司，C1121)，胰酶細(xì)胞消化液(碧云天生物公司，C0201)，Triton X-100(上海生工，T0694)，其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純.HepG2細(xì)胞由杭州師范大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心劉曉玲老師提供，細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生化公司，新生小牛血清購自杭州四季青生物公司.

1.2 主要儀器

DYY-2C型電泳儀(北京六一儀器廠)，DYCP-31DM型電泳槽(北京六一儀器廠)，Incustar 210型CO2培養(yǎng)箱(BioSOURCE公司)，BX-51熒光顯微鏡(日本Omachi)，ProgRes數(shù)碼照相系統(tǒng)(德國Jenoptik).

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

HepG2細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10%新生小牛血清及1%青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2～3 d換一次液.處理前，將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞于1 ml DMEM完全培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h.第二天進(jìn)行處理，先除去培養(yǎng)基，細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗2次后每孔換上1 ml無血清培養(yǎng)基，然后分別用稀釋于PBS中的甲醛(0.25，2.5，25 μmol/L)單獨(dú)處理或甲醛與硫辛酸((5+20)，(5+40) μmol/L)同時(shí)處理2 h.處理結(jié)束后用胰酶消化收集細(xì)胞，每次實(shí)驗(yàn)每種濃度分別收集3個(gè)復(fù)孔細(xì)胞，每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，求其平均值及標(biāo)準(zhǔn)差.

1.4 苔盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性

HepG2細(xì)胞經(jīng)各種不同處理2 h后，消化收集細(xì)胞用0.4%苔盼藍(lán)染色5 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)染成藍(lán)色細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)，求出百分比，以測定各種不同處理后HepG2細(xì)胞其活性.該研究中各種不同處理HepG2細(xì)胞用于彗星試驗(yàn)時(shí),其活性至少在80%以上.

1.5 彗星試驗(yàn)

圖1 甲醛單獨(dú)處理后HepG2細(xì)胞尾部DNA百分率變化Fig. 1 Change on the tail DNA percentage of HepG2 cells after treated with formaldehyde alone

按照Singh等[5]描述方法進(jìn)行，略有改進(jìn).1)制片：取1.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，加熱熔化后，冷卻至45 ℃.取100 μl滴于潔凈的磨砂載玻片上，立即蓋上蓋玻片，使瓊脂糖均勻地展開在載玻片上，置4 ℃下10 min，待瓊脂糖冷卻變硬后即為第一層.取下蓋玻片，取新鮮制備的細(xì)胞懸液25 μl(含104個(gè)細(xì)胞)與25 μl 1%低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液在37 ℃下混勻，迅速滴在第一層瓊脂糖膠上，立即蓋上蓋玻片，4 ℃固化10 min，即為第二層膠.2)裂解：取下蓋玻片，將凝膠載玻片浸沒于新配制的裂解液(2.5 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris，1%十二烷基肌氨酸鈉，pH 10，用前加入1% Triton X-100和10% DMSO)中，4 ℃下避光裂解2 h.3)解旋：取出載玻片，蒸餾水漂洗3 min.放入電泳槽中，倒入新鮮配制的電泳緩沖液(1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 13)，電泳液應(yīng)高過膠面0.25 cm，蓋上蓋子，避光靜置20 min，使雙鏈DNA在堿性條件下解旋成單鏈DNA.4)電泳：電壓25 V，電流300 mA，低溫避光，電泳時(shí)間30 min.5)中和：電泳結(jié)束后，將載玻片放入中和液(0.4 mol/L Tris，pH 7.5)中洗滌3次，每次5 min，除去堿和去污劑，以免影響染色效果.6)染色、觀察與拍照：在避光條件下，滴加30 μl溴化乙錠(25 mg/ml)染色15 min，用蒸餾水小心洗掉表面染料，加上蓋片，24 h內(nèi)用連有ProgRes數(shù)碼照相系統(tǒng)的BX-51熒光顯微鏡觀察并拍照，激發(fā)波長549 nm，濾過波長590 nm，以400倍拍攝單細(xì)胞影像.

1.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

各處理濃度隨機(jī)選取150個(gè)單細(xì)胞影像用彗星圖像分析軟件casp-1.2.2(http://www.casp.of.pl/)分析細(xì)胞尾部DNA百分率，用Student’st-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié) 果

2.1 甲醛單獨(dú)處理后HepG2細(xì)胞尾部DNA百分率變化

單細(xì)胞影像用彗星圖像分析軟件分析后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同濃度甲醛(0.25，2.5，25 μmol/L)單獨(dú)處理HepG2細(xì)胞2 h后，HepG2細(xì)胞尾部DNA百分率隨甲醛濃度增加而逐漸升高，各個(gè)濃度處理組與不處理對照組相比差異極顯著(P<0.01)(見圖1).已知細(xì)胞尾部DNA百分率與細(xì)胞DNA鏈斷裂損傷水平成正比，細(xì)胞尾部DNA百分率越高表示其DNA鏈斷裂損傷越多.因此，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明甲醛對人HepG2細(xì)胞DNA有損傷作用.

2.2甲醛與硫辛酸同時(shí)處理后HepG2細(xì)胞尾部DNA百分率變化

圖2 甲醛與硫辛酸同時(shí)處理后HepG2細(xì)胞尾部DNA百分率變化Fig. 2 Change on the tail DNA percentage of HepG2 cells after treated with formaldehyde and lipoic acid together

單細(xì)胞影像用彗星圖像分析軟件分析后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，甲醛與硫辛酸((5+20)，(5+40) μmol/L)同時(shí)處理HepG2細(xì)胞2 h后，HepG2細(xì)胞尾部DNA百分率明顯降低并與硫辛酸濃度呈依賴關(guān)系，與甲醛單獨(dú)處理組(5 μmol/L)相比差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01)(見圖2).由于細(xì)胞尾部DNA百分率與細(xì)胞DNA鏈斷裂損傷水平成正比，細(xì)胞尾部DNA百分率越低表示其DNA鏈斷裂損傷越少.因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示硫辛酸對甲醛誘發(fā)人HepG2細(xì)胞DNA損傷有保護(hù)作用.

3 討 論

環(huán)境中的甲醛主要經(jīng)人體呼吸道和胃腸道吸收，肝臟是體內(nèi)解毒的主要部位.HepG2細(xì)胞來源于人肝臟胚胎瘤細(xì)胞，它保留了正常肝細(xì)胞的許多生物學(xué)特性，擁有較完整的代謝酶系，因此，HepG2細(xì)胞常被作為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)用于檢測各種遺傳毒性物質(zhì)[6].許多研究已報(bào)道甲醛對多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞有遺傳毒性作用，能導(dǎo)致細(xì)胞形成DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物[1-2,7-8].筆者以HepG2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，甲醛既可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生DNA鏈斷裂又可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞形成DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物.DNA損傷的類型取決于甲醛濃度，低濃度的甲醛誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生DNA鏈斷裂損傷，而較高濃度的甲醛則誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞形成DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物[9-10].

硫辛酸最初是作為一種類維生素被分離發(fā)現(xiàn)的，它天然存在于動(dòng)植物和人體中，在能量代謝方面起重要作用，是體內(nèi)ATP產(chǎn)生過程中必不可少的輔助因子，參與三羧酸循環(huán)中α-酮酸的氧化脫羧反應(yīng).一直以來人們對硫辛酸的認(rèn)識(shí)主要局限在其能量代謝方面的作用，但近年來研究證明，硫辛酸還是一種廣泛性的抗氧化劑，在細(xì)胞保護(hù)、清除自由基、抗氧化等方面具有廣泛的作用[3-4].該研究中，不同濃度甲醛單獨(dú)處理后HepG2細(xì)胞尾部DNA百分率顯著升高，說明甲醛能誘發(fā)HepG2細(xì)胞DNA損傷，但甲醛與硫辛酸同時(shí)處理后HepG2細(xì)胞尾部DNA百分率則明顯降低，揭示硫辛酸對甲醛誘發(fā)的HepG2細(xì)胞DNA損傷有保護(hù)作用.此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了硫辛酸是一種抗氧化劑，它能有效保護(hù)人體細(xì)胞DNA氧化損傷，但關(guān)于硫辛酸抗氧化作用的分子機(jī)理還有待進(jìn)一步研究.

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