八面蒙脫石聯(lián)合莫沙必利灌胃對急性壞死性胰腺炎大鼠回腸NF-κB活化的影響

許娟娟 彭晶晶 胡耿誠 錢偉 丁震 劉俊 侯曉華

·論著·

八面蒙脫石聯(lián)合莫沙必利灌胃對急性壞死性胰腺炎大鼠回腸NF-κB活化的影響

許娟娟 彭晶晶 胡耿誠 錢偉 丁震 劉俊 侯曉華

目的探討八面蒙脫石對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠回腸黏膜NF-κB活化的影響。方法120只雄性SD大鼠按完全隨機法分為假手術組、ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組和莫沙比利+八面蒙脫石(聯(lián)合)組，每組24只大鼠。采用胰膽管內逆行注射?；悄懰徕c誘導大鼠ANP模型；假手術組開腹注射生理鹽水后關腹。各治療組于造模前30 min分別給予相應藥物灌胃1次。術后3、6、12 h分批處死動物。取胰腺組織行病理檢查；取血測定TNF-α、IL-1水平；取回腸觀察超微結構的改變；免疫組化法檢測回腸黏膜NF-κB的表達；Western blotting法檢測回腸組織IκBα水平。結果與假手術組比較，ANP組胰腺損傷明顯，血TNF-α、IL-1水平明顯升高[(36.79±1.14)pg/ml對(9.00±0.01)pg/ml，(25.17±1.93)ng/ml對(3.45±0.11)ng/ml,P值均<0.05]，回腸絨毛高度顯著下降[(0.25±0.22)×10-6m對(1.50±0.33)×10-6m，P<0.05]，柱狀細胞指數(shù)顯著降低[(2.40±1.65)×106個/m對(13.5±4.28)×106個/m，P<0.05]，NF-kB表達增加(6.92±1.54對1.28±0.29，P<0.05)，IκBα蛋白水平下降(3.30±1.99對24.32±1.93 )。莫沙必利組和八面蒙脫石組的各項指標與ANP組均無顯著差異。聯(lián)合組的血TNF-α、IL-1水平[(30.57±0.39)pg/ml和(13.45±1.26)ng/ml]、回腸絨毛高度和柱狀細胞指數(shù)[(1.05±0.28)×10-6m和(10.10±2.50)×106個/m]、NF-kB活化(4.32±1.57)和IκBα蛋白水平(15.99±1.26)均與ANP組有統(tǒng)計學差異(P值均<0.05)。結論八面蒙脫石聯(lián)合莫沙必利灌胃能減少ANP大鼠回腸黏膜NF-κB的大量激活，減輕胰腺和回腸黏膜的損傷程度。

胰腺炎，急性壞死性； NF-κB； IκBα； 回腸； 八面蒙脫石； 莫沙必利

重癥急性胰腺炎(SAP)是常見的急腹癥之一，其發(fā)病機制較為復雜，有多種因子參與并起著非常重要的作用[1]。NF-κB作為重要的基因轉錄因子，在SAP中高表達并對SAP的發(fā)生發(fā)展起重要作用[2]。八面蒙脫石可吸附多種病原體，保護腸黏膜屏障，減少因細菌內毒素易位而引起的炎癥介質過度釋放[3]。因此，本研究應用八面蒙脫石治療急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，觀察其對腸道損傷的保護作用，為臨床應用打下基礎。由于ANP時常并發(fā)腸蠕動減緩，為確保八面蒙脫石到達腸道，本實驗加用促胃腸動力藥莫沙必利。

材料和方法

一、動物模型制備及實驗分組

120只雄性SD大鼠，體重200～250 g，清潔級，由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物中心提供。大鼠按完全隨機法分為假手術組、ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組和八面蒙脫石+莫沙必利(聯(lián)合)組，每組24只。采用逆行胰膽管注射牛磺膽酸鈉制備ANP模型[4]。假手術組開腹注射生理鹽水后關腹，其他各組于造模前30 min分別應用生理鹽水、0.03%莫沙必利、6%八面蒙脫石、莫沙必利+八面蒙脫石灌胃1次，灌胃劑量為0.1 ml/100 g體重。術后3、6、12 h分批處死大鼠。

二、血TNF-α、IL-1檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法，按試劑盒說明書操作。

三、胰腺及回腸組織病理檢查

胰腺組織常規(guī)行病理學檢查，按照許永春等[4]的標準評分?；啬c組織送華中科技大學同濟醫(yī)學院電鏡中心行超微結構檢查。

四、回腸組織NF-κB表達的檢測

采用S-P免疫組化法。一抗工作濃度為1∶100。每張切片取5個視野，應用Image-Pro Plus分析軟件測定NF-κB蛋白陽性產(chǎn)物的積分光密度值，取均值。

五、回腸組織IκBα表達的檢測

取50 mg回腸組織，用PIRA裂解液制備勻漿，蛋白定量后行Western blotting。用惠普掃描儀掃描，quantity one軟件計算各條帶灰度值，以IκBα/β-actin的灰度值比作為IκBα相對表達量。

六、統(tǒng)計學方法

結 果

一、胰腺組織病理學改變

假手術組胰腺正常。ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組大鼠初期胰腺水腫，以后出現(xiàn)皂化斑及出血壞死灶，有血性腹水；鏡下胰腺間質水腫，隨時間延長，腺泡小葉結構破壞，出血，凝固性或脂肪壞死，大量中性粒細胞和單核細胞浸潤。聯(lián)合組胰腺損傷明顯減輕，胰腺病理評分較ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組顯著降低(P<0.05，圖1、圖2)。

圖1 假手術組(a)、ANP組(b)、莫沙必利組(c)、八面蒙脫石組(d)和聯(lián)合組 (e) 6 h點的胰腺病理改變(HE ×20)

注：與假手術組比較,aP<0.05;與ANP組比較,bP<0.05

二、回腸組織超微結構改變

假手術組回腸絨毛高度為(1.50±0.33)×10-6m；柱狀細胞指數(shù)(柱狀細胞數(shù)/肌層黏膜長度)為(13.5±4.28)×106個/m。ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組回腸組織緊密連接條索縮短、數(shù)量減少甚至結構模糊，細胞凋亡明顯增加(圖3)，回腸絨毛高度分別為(0.25±0.22)×10-6m、(0.38±0.27)×10-6m、(0.33±0.26)×10-6m；柱狀細胞指數(shù)分別為(2.40±1.65)×106個/m、(3.00±1.43)×106個/m、(2.60±2.52)×106個/m。均顯著低于假手術組(P值均<0.05)。聯(lián)合組為(1.05±0.28)×106m和(10.10±2.50)×106個/m，均顯著高于上述3組(P<0.05)，而與假手術組無顯著差異。

三、各組血TNF-α、IL-1水平的變化

ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組血清TNF-α、IL-1水平較假手術組明顯升高(P值均<0.05)，而聯(lián)合組較上述3組顯著降低(P值均<0.05)，但仍顯著高于假手術組(表1，P<0.05)。

四、回腸黏膜組織NF-κB表達

假手術組少見NF-κB的陽性表達；ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組見大量NF-κB陽性細胞,主要位于腸絨毛頂端的腸上皮細胞和靠近腸絨毛頂端的單核細胞；聯(lián)合組活化細胞數(shù)減少(圖4)。5組NF-κB 活化量分別為1.28±0.29、6.92±1.54、6.28±1.59、6.34±1.43和4.32±1.57。聯(lián)合組較ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組顯著減少(P值均<0.05)，但仍高于假手術組(P<0.05)。

表1 各組大鼠血TNF-α和IL-1水平的變化

注：與假手術組比較,aP<0.05;與ANP組比較,bP<0.05

五、回腸組織IκBα蛋白水平的變化

假手術組3、6、12 h的 IκBα蛋白表達量分別為25.17±0.56、24.32±1.93、24.01±1.12；ANP組為4.46±1.45、3.30±1.99、3.36±1.23；莫沙比利組為7.46±3.57、4.54±1.67、5.43±4.09；八面蒙脫石組為6.23±3.12、4.11±1.47、3.13±2.96；聯(lián)合組為17.35±0.95、15.99±1.26、18.23±1.94。ANP組與莫沙比利組及八面蒙脫石組無明顯差異；聯(lián)合組較上述3組均明顯增加(P值均<0.05，圖5)。

圖3假手術組(a)、ANP組(b)、莫沙比利組(c)、八面蒙脫石組(d)和聯(lián)合組 (e) 6 h點的回腸組織超微結構變化( ×4000)

圖4假手術組(a)、ANP組(b)、莫沙比利組(c)、八面蒙脫石組(d)和聯(lián)合組 (e) 6 h點的回腸黏膜組織NF-κB 的活化狀況( ×20)

圖5 各組回腸組織IκBα蛋白表達

討 論

文獻報道[5-7]，八面蒙脫石可通過自身與腸黏液分子間的相互作用，增加黏液的內聚力、粘彈性和存在時間，從而保護腸細胞頂端和細胞間橋免受損壞，促進上皮細胞再生和修復，同時可以覆蓋在消化道黏膜表面，加強由黏液免疫球蛋白A和正常菌群組成的黏膜防御屏障，恢復腸上皮細胞的正常吸收分泌功能。但其在SAP時的應用尚未見報道。因急性胰腺炎時小腸動力功能減退[8]，導致藥物無法順利到達腸道發(fā)揮作用，為此，本文聯(lián)合應用促胃腸蠕動劑莫沙必利，以保證八面蒙脫石到達腸道充分發(fā)揮藥物作用。實驗結果顯示，聯(lián)合組大鼠回腸絨毛高度和柱狀細胞指數(shù)均顯著高于ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組，而與假手術組無顯著差異，提示聯(lián)合應用莫沙必利和八面蒙脫石能減輕腸黏膜的損傷。

NF-κB在全身炎癥反應綜合征(SIRS)的發(fā)生過程中起著核心作用，調節(jié)多種炎癥介質的基因轉錄[9]。本實驗結果顯示，聯(lián)合組NF-κB活化較ANP組、莫沙必利組和八面蒙脫石組顯著減少，而IκBα蛋白顯著增加，表明聯(lián)合應用莫沙必利和八面蒙脫石才能保證八面蒙脫石抑制NF-κB活化的作用。

研究證實，NF-κB對TNF-α的表達具有調節(jié)作用[10]。而TNF-α又可激活IL-1、IL-6、IL-8、白細胞趨化因子、黏附分子等細胞因子。本實驗聯(lián)合組大鼠血TNF-α和IL-1的水平均明顯較ANP組、莫沙必利組、八面蒙脫石組下降，可能與八面蒙脫石減少了NF-κB的大量活化有關。

此外，當聯(lián)合給予八面蒙脫石和莫沙必利灌胃后，除了回腸組織損傷好轉外，胰腺的病理損傷也減輕，表明八面蒙脫石同樣能減輕胰腺的損傷。

[1] Deitch EA，Bridges W，Baker J，et al．Hemorrhagic shock-induced bacterial translocation is reduced by xanthine oxidase inhibition or inactivation．Surgery，1988，104：191-198.

[2] Ikeda H,Suzuki Y,Suzuki M,et al.Apoptosis is a major mode of cell death caused by ischaemia and ischaemia/reperfusion injury to the rat intestinal epithelium.Gut,1998,42:530-537.

[3] 胡彩虹,夏枚生,熊莉,等. 蒙脫石對細菌黏附Caco-2細胞的影響. 細胞生物學雜志.2006，28：76-78.

[4] 許永春,李兆申,屠振興,等. 改良逆行膽胰管注射法制備輕重不同兩種大鼠急性胰腺炎模型. 第二軍醫(yī)大學學報，2004，25：1251-1252.

[5] 陳春謙，金有豫，湯光. 新編藥物學.15版.北京: 人民衛(wèi)生出版社,2003:462.

[6] 朱玲. 思密達聯(lián)合得舒特治療腹瀉型腸易激綜合癥療效觀察. 中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志,2008,10:127.

[7] 梁若玲. 思密達治療腸易激綜合癥療效觀察. 胃腸病學和肝臟病學雜志,2001,10:117.

[8] Van Minnen LP, Blom M,Timmerman HM,et al. The use of animal models to study bacterial translocation during acute pancreatitis. J Gastrointest Surg, 2007,11: 682-689.

[9] 張喜平，陳林杰.NF-kB及其在急性胰腺炎中的作用.醫(yī)學研究雜志，2007，36：17-20.

[10] Wang YL, Zhang SD，Zheng YJ,et al. Effects of gut barrier dysfunction and NF-kappaB activation on aggravating mechanism of severe acute pancreatitis. J Dig Dis,2009,10:30-40.

2009-03-31)

(本文編輯：屠振興)

RoleofoctahedralmontoneandmosaprideonileumNF-κBactivationinratswithacutenecrotizingpancreatitis

XUJuan-juan,PENGJing-jing,HUGeng-cheng,QIANWei,DINGZheng,LIUJun,HOUXiao-hua.

DepartmentofGastroenterology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

LIUJun,Email:liujun-99@126.com

ObjectiveTo investigate the role of octahedral montone on ileum NF-κB activation in rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP).Methods120 SD rats were randomly divided into sham-operation group (A), ANP group (B), mosapride treatment group (C), montone treatment group (D), montone and mosapride treatment group (E). Retrograde pancreatic duct injection of sodium taurocholate was used to establish ANP models, octahedral montone and mosapride were given by intragastric feeding 30 min before ANP model induction. group A was injected NS after opening the abdomen. Pancreatic tissue injury was evaluated; the serum level of TNF-α and IL-1 was determined; the ultrastructural changes of the ileum was observed.The expression of NF-κB in the ileum mucosa was detemined by immunohistochemistry. The expression of IκBα protein in the ileum tissue was determined by Western blotting.ResultsCompared with group A, pancreatic tissue injury was more severe in group B, and serum level of TNF-α and IL-1 was much higher in group B[(36.79±1.14)vs(9.00±0.01)pg/ml, (25.17±1.93)vs(3.45±0.11)ng/ml,P<0.05]; the height of the villi was significantly lower [(0.25±0.22)×10-6mvs(1.50±0.33)×10-6m,P<0.05)], the index of columnar cell was significantly lower [(2.40±1.65)×10-6mvs(13.5±4.28)×106/m,P<0.05)]; the expressions of NF-κB was significantly eleveted (6.92±1.54vs1.28±0.29,P<0.05), the expressions of IκBα protein was significantly decreased (3.30±1.99vs24.32±1.93). There was no significant difference between group D and C. The serum level of TNF-α and IL-1 [(30.57±0.39)pg/ml and (13.45±1.26)ng/ml], the height of the villi and the index of columnar cell [(1.05±0.28)×10-6m and (10.10±2.50)×106/m] and the expressions of NF-kB (4.3240±1.5657) and IκBα (15.987±1.262) was statistically significantly different compared with those of the ANP group (P<0.05).ConclusionsOctahedral montone and mosapride could decrease the NF-κB activation and ameliorate the inflammation of ileum and pancreas during the course of ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; NF-κB; IκBα; Ileum; Octahedral montone; Mosapride

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.015

430022 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內科

劉俊，Email: liujun-99@126.com