谷氨酰胺對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用及機(jī)制

彭晶晶 陳婕 許娟娟 胡耿誠 孟慶彬 丁震 錢偉 侯曉華

·短篇論著·

谷氨酰胺對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用及機(jī)制

彭晶晶 陳婕 許娟娟 胡耿誠 孟慶彬 丁震 錢偉 侯曉華

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)時(shí)的細(xì)菌感染主要是由于腸黏膜屏障破壞導(dǎo)致腸道細(xì)菌易位所致[1-2]。谷氨酰胺作為腸黏膜的重要能源物質(zhì)，同時(shí)也是核苷酸合成的重要底物，能夠起到保護(hù)腸黏膜屏障，增強(qiáng)腸道免疫功能，降低炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放的作用[3-5]。但其具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)價(jià)谷氨酰胺灌腸對(duì)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用，探討其機(jī)制。

一、材料和方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康雄性SD大鼠72只，清潔級(jí)，體重200～250 g，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按完全隨機(jī)的方法分為假手術(shù)組、ANP組和谷氨酰胺組，每組又分術(shù)后3、6、12 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各8只。ANP模型制作參照Schmidt等和許永春等的方法[6-7]；假手術(shù)組向腹腔內(nèi)注射生理鹽水；谷氨酰胺組在術(shù)前30 min按谷氨酰胺1 ml/kg體重灌腸。

2．胰腺組織病理學(xué)檢測(cè)：按常規(guī)進(jìn)行。

3．血漿TNF-α、DAO及內(nèi)毒素測(cè)定：血漿TNF-α采用ELISA法，DAO(Sigma公司)采用分光光度法，內(nèi)毒素采用鱟試劑顯色基質(zhì)法(上海伊華生物有限公司)檢測(cè)。

4．回腸超微結(jié)構(gòu)觀察：快速取術(shù)后6 h處死的大鼠末端回腸組織，鋨酸固定后，送華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院電鏡中心檢查。

5．回腸組織細(xì)胞間緊密連接Occludin蛋白檢測(cè)：采用常規(guī)Western blotting法檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參。Occludin蛋白表達(dá)值以目的蛋白條帶和β-actin條帶吸光值的比值表示。

二、結(jié)果

1．胰腺組織病理學(xué)改變：假手術(shù)組胰腺未見異常； ANP組初期見胰腺間質(zhì)水腫，腺泡細(xì)胞變形，少量中性粒細(xì)胞浸潤，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，腺泡小葉結(jié)構(gòu)破壞，實(shí)質(zhì)出血，凝固性或脂肪壞死，大量中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤；谷氨酰胺組胰腺的上述病理性損傷明顯減輕(圖1)。

圖1假手術(shù)組(a)、ANP組(b)、谷氨酰胺(c)組6 h時(shí)的病理改變(HE ×400)

2．血TNF-α、DAO及內(nèi)毒素含量變化：ANP組的血TNF-α、DAO及內(nèi)毒素含量均顯著高于同時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組(P值均<0.01)；谷氨酰胺組血TNF-α、DAO及內(nèi)毒素含量均顯著低于同時(shí)間點(diǎn)的ANP組，但仍顯著高于假手術(shù)組(P值均<0.01，表1)。

表1 各組血TNF-α、DAO及內(nèi)毒素的變化

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.01

3．回腸超微結(jié)構(gòu)改變：假手術(shù)組大鼠回腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞游離緣絨毛排列整齊，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞間及頂端有明顯的連接復(fù)合體(圖2a)。ANP組大鼠回腸黏膜微絨毛稀疏、斷裂、脫落，微絨毛高度較假手術(shù)組明顯縮短；細(xì)胞間緊密連接條索縮短、數(shù)量減少甚至結(jié)構(gòu)模糊；回腸黏膜厚度降低(圖2b)。谷氨酰胺組大鼠回腸微絨毛稍稀疏，排列尚整齊，緊密連接基本完整，微絨毛高度較ANP組增高，回腸黏膜厚度增加(圖2c)。

圖2假手術(shù)組(a)、ANP組(b)、谷氨酰胺組(c)6 h時(shí)的回腸超微結(jié)構(gòu)(×40000)

4．回腸組織Occludin蛋白的表達(dá)：假手術(shù)組3、6、12 h時(shí) Occludin蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.22±0.27、1.21±0.25、1.19±0.33；ANP組分別為0.20±0.07、0.21±0.05、0.16±0.08；谷氨酰胺組分別為0.64±0.10、0.55±0.08、0.59±0.08。ANP組較假手術(shù)組均顯著減少(P值均<0.05)，而谷氨酰胺組較ANP組均顯著增加，但仍顯著低于假手術(shù)組(P值均<0.05，圖3)。

1、2、3：谷氨酰胺3、6、12 h組；4：假手術(shù)組；5、6、7：ANP 3、6、12 h組

圖3腸黏膜Occludin蛋白免疫印跡

討論TNF-α是急性胰腺炎的始動(dòng)因子之一[8]。文獻(xiàn)報(bào)道，血清TNF-α在大鼠ANP誘導(dǎo)后1 h就明顯升高,隨后在6 h內(nèi)急劇上升,并與胰腺損傷和炎癥的嚴(yán)重程度密切相關(guān),可作為早期評(píng)估胰腺炎癥程度的指標(biāo)之一[9]。腸黏膜屏障主要由腸黏膜機(jī)械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障和生物屏障四部分組成，其中由腸道黏膜上皮細(xì)胞、細(xì)胞間緊密連接(tight junction，TJ)構(gòu)成的腸黏膜機(jī)械屏障是腸屏障功能的最主要組成部分之一,能有效阻止細(xì)菌穿透黏膜進(jìn)入深部組織[10-11]。Occuldin是TJ中最重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，是腸黏膜通透性調(diào)節(jié)的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]。血清DAO含量是評(píng)價(jià)創(chuàng)傷和應(yīng)激情況下腸黏膜屏障功能障礙的理想指標(biāo)之一[13]。腸屏障功能障礙,導(dǎo)致細(xì)菌和(或)內(nèi)毒素易位，可形成腸源性內(nèi)毒素血癥。因此，Occuldin表達(dá)、血DAO及內(nèi)毒素水平均是反映腸黏膜屏障的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， ANP大鼠血TNF-α水平在早期即明顯升高， 6 h達(dá)峰值。同時(shí)，血DAO、內(nèi)毒素水平明顯升高，回腸黏膜Occludin蛋白表達(dá)明顯下降。預(yù)防性應(yīng)用谷氨酰胺灌腸后，大鼠血TNF-α、DAO及內(nèi)毒素水平均較ANP大鼠顯著降低，回腸黏膜Occludin蛋白的表達(dá)明顯增加，但仍較假手術(shù)組高，提示谷氨酰胺能在一定程度上改善腸黏膜屏障的損傷程度。通過對(duì)回腸黏膜超微結(jié)構(gòu)的觀察，谷氨酰胺灌腸的大鼠腸黏膜微絨毛高度較ANP大鼠明顯增高，密度也增加，進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)上證實(shí)谷氨酰胺對(duì)腸黏膜的保護(hù)作用。表明谷胺酰胺可能通過上調(diào)腸黏膜Occuldin蛋白表達(dá)，改善腸黏膜機(jī)械屏障,進(jìn)而減輕了內(nèi)毒素血癥，為其臨床應(yīng)用提供了新的途徑和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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2009-08-05)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.025

430022 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科

陳婕，Email:jichen07@yaho.com