荊防敗毒顆粒治療雞新城疫的臨床試驗(yàn)

王艷萍,董 林,沈志強(qiáng),郭時(shí)金,張 穎,張志美,周春鳳

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州256600;2.山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司,山東濱州256600)

目前對(duì)新城疫的防治采用雞新城疫病毒(NDV)疫苗接種,即能收到較好效果,但由于SPF蛋的缺乏,疫苗生產(chǎn)質(zhì)量、疫苗運(yùn)輸、保存條件和免疫程序的選擇、免疫抑制病的發(fā)生等因素的影響使NDV疫苗的應(yīng)用受到一定的影響,尤其在雞新城疫發(fā)生時(shí),防治效果不夠理想,使雞新城疫仍為危害養(yǎng)雞業(yè)的最大疫病之一[1]。為此,山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司與山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院聯(lián)合研制了新獸藥制劑“荊防敗毒顆?！?為了驗(yàn)證其臨床效果,我們進(jìn)行了以下試驗(yàn)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 健康21日齡海藍(lán)灰公雛500只,隔離飼養(yǎng),血清學(xué)檢驗(yàn)ND母源抗體HI≤2。

1.2 藥物 試驗(yàn)藥物：荊防敗毒顆粒(主要成分：胡薄荷酮、α-蒎烯、薄荷醇),批號(hào) 20071210,山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司研制。

對(duì)照藥物：荊防敗毒散(主要成分：荊芥、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡等),批號(hào) 20070424,山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 毒株 NDV F 48 E8株 購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 抗原及血清 雞抗F48E8亞型NDV陽性血清、F48 E8亞型NDV標(biāo)準(zhǔn)抗原均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.5 雞胚 9～11日齡SPF雞胚,購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。

2 試驗(yàn)方法

2.1 雞群分組與攻毒 將500只雞隨機(jī)分成10組,每組50只,編號(hào)并記錄每只雞的體重、生長發(fā)育。攻毒：無菌條件下,將F48E8株 NDV 105EID50 1 000倍稀釋,0.1 mL/只肌肉注射。

2.2 組別分類

第1～3組：藥物預(yù)防組(攻毒前3 d分別在飲水中添加“荊防敗毒顆?！?.2 g/d?只、0.8 g/d?只、0.5 g/d?只,連用 3 d)。

第4組：藥物預(yù)防對(duì)照組(攻毒前3 d分別在飼料中添加“荊防敗毒散”劑量為1 g/d?只,連用3 d)。

第5～7組：藥物治療組(攻毒并出現(xiàn)明顯癥狀后,以“荊防敗毒顆?！憋嬎委?劑量為2 g/d?只、1.5 g/d?只、0.8 g/d?只,連用5 d)。

第8組：藥物治療對(duì)照組(將攻毒出現(xiàn)明顯癥狀的雞以“荊防敗毒散”治之,2 g/d?只拌料,連用5 d)。

第9組：空白對(duì)照組(即不攻毒,不用藥組)。第10組：陽性對(duì)照組(即攻毒不用藥組)。

2.3 病料的采集與處理[2]該試驗(yàn)共持續(xù)15 d,每天觀察雞的臨床表現(xiàn),對(duì)各試驗(yàn)組每天用棉拭子隨機(jī)采10只雞的咽喉及泄殖腔黏液,將蘸取黏液的棉拭子立即放入 Hank′s中,充分振蕩,使黏液分散,3 000 r/min離心15 min,取上清,用于接種雞胚。

對(duì)試驗(yàn)過程中死亡的雞及試驗(yàn)結(jié)束后存活的雞剖殺,采集心、肝、肺、脾、腎等臟器研磨后 2 000 r/min離心 15 min,取上清,接種雞胚。

2.4 病毒的增殖 取2.3處理的樣品各1 mL分別置于滅菌的2 mL離心管中,之后加入200μL雙抗,37℃感作1 h,再用0.45μm 的微孔濾膜過濾除去雜質(zhì),濾液接種9～11日齡SPF雞胚絨毛尿囊腔,0.2 mL/胚,每個(gè)樣品接3個(gè)胚,同時(shí)用生理鹽水代替病毒,接種同批雞胚作為陰性對(duì)照,37℃繼續(xù)孵化,每天照蛋2次并棄去24 h內(nèi)死胚,無菌收取24～96 h內(nèi)的雞胚尿囊液并觀察雞胚病變,采用微量血凝試驗(yàn)(HA)測(cè)定其血凝效價(jià)。

2.5 1%雞紅細(xì)胞懸液的制備 采取健康公雞血液用2%枸櫞酸鈉鹽水抗凝,放入50 mL的錐形離心管中,加入5倍體積的PBS緩沖(p H值7.4),3 000 r/min離心10 min,吸去上清和淡黃色的白細(xì)胞層,5倍體積的PBS緩沖(pH值7.4),3 000 r/min離心5 min棄去上清;重復(fù)用PBS洗兩遍,重懸至終體積12 mL,放入15 mL有刻度的錐形離心管中;3 000 r/min離心10 min,估計(jì)沉淀細(xì)胞的體積,稀釋到大致所需濃度。

2.6 微量血凝試驗(yàn)(HA) 具體操作步驟如下,在96孔“V”型微量血凝板的1～12孔均加入50μL生理鹽水。用微量移液器吸取50μL待檢抗原(即尿囊液)加入到第1孔,混勻。從第1孔吸取50μL抗原液加入第2孔,混勻后吸取50μL加入第3孔,如此進(jìn)行倍比稀釋至第11孔,從第11孔吸取50μL棄之,第12孔加入50μL生理鹽水作為對(duì)照。每孔加入50μL 1%雞紅細(xì)胞懸液,在微量振蕩器上混勻,室溫下靜置20～30 min后觀察結(jié)果。

2.7 判定標(biāo)準(zhǔn)

2.7.1 臨床判定標(biāo)準(zhǔn) 輕者：癥狀出現(xiàn)時(shí)間較遲,精神沉郁,采食量略減(10～20分);輕微：排黃綠色糞便,采食、精神正常(30分);重者：癥狀出現(xiàn)時(shí)間早,昏睡,呆立不動(dòng)或臥地不起,采食量減少或廢絕(100分)。剖檢存在以下癥狀,輕微：個(gè)別腺胃乳頭出血,肌胃局部點(diǎn)狀出血,腸道淋巴出血或腫脹,盲腸扁桃體腫脹;中等：乳頭間大片出血,肌胃出血,腸道出血,盲腸扁桃體出血;嚴(yán)重：乳頭間彌漫性出血,肌胃大面積出血,盲腸扁桃體壞死,泄殖腔彌漫性出血。

2.7.2 用藥5 d后判定標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)病：試驗(yàn)期間,出現(xiàn)雞新城疫(ND)臨床癥狀和/或尸體剖檢有ND特征病變者定為發(fā)病;死亡：試驗(yàn)期間死亡,并出現(xiàn)ND臨床癥狀和/或尸體剖檢有ND特征病變者,判定為感染死亡;保護(hù)：試驗(yàn)期間,預(yù)防組未死亡雞均定為保護(hù);痊愈：受試雞精神、食欲、糞便均恢復(fù)正常;有效：除完全治愈的雞屬于有效外,經(jīng)用藥精神好轉(zhuǎn),食欲、糞便有所恢復(fù),與對(duì)照組比較死亡時(shí)間顯著延長者,可判定有效;無效：受試雞用藥后精神、食欲、糞便未見好轉(zhuǎn),甚至加重死亡。

3 結(jié)果與分析

3.1 發(fā)病及臨床防治效果與分析 見表1。

表1 荊防敗毒顆粒對(duì)雞人工感染ND的防治效果

攻毒后 24 h第 5、6、7、8、10組即排綠色糞便,72 h 第 5、6、7、8、10 組雞表現(xiàn)精神沉郁,食欲消失或廢絕,羽毛松亂無光澤,垂頭縮頸,翅膀下垂,冠和肉髯發(fā)紺,眼半閉或全閉,似昏睡狀態(tài),排黃綠色或黃白色稀便,嗉囊脹滿,從病雞口中流出酸臭黏液。預(yù)防1、2、3、4組于 72 h出現(xiàn)明顯癥狀。

高、中、低劑量治療組治愈率分別為 90%、88%、72%,藥物對(duì)照治療組治愈率為70%,其中高劑量治療組與中劑量治療組之間差異不顯著(P＞0.05),中劑量治療組與低劑量治療組之間差異極顯著(P＜0.01),中劑量治療組與藥物對(duì)照治療組之間差異極顯著(P＜0.01);高、中、低劑量預(yù)防組保護(hù)率分別為90%、88%、76%,藥物對(duì)照預(yù)防組保護(hù)率為70%,其中高劑量預(yù)防組與中劑量預(yù)防組之間差異不顯著(P＞0.05),中劑量預(yù)防組與低劑量預(yù)防組之間差異顯著(P＜0.01、P＜0.05),中劑量預(yù)防組與藥物對(duì)照預(yù)防組之間差異極顯著(P＜0.01)。

3.2 血凝試驗(yàn)結(jié)果與分析 于給藥后第1、2、3、7、10、11、14天采集各試驗(yàn)組雞的咽喉及泄殖腔黏液,按2.4病毒增殖后取尿囊液用微量法血凝試驗(yàn)(HA)測(cè)其血凝效價(jià),結(jié)果見表2。

表2 給藥后檢測(cè)血凝(HA)效價(jià)(log2)的結(jié)果

結(jié)果顯示,荊防敗毒顆粒高劑量治療組第1天血凝效價(jià)為2.9±0.74、2～14 d為0;中劑量治療組第1天所測(cè)得的血凝效價(jià)均為2.9±2.60、第2天為2.4±0.84,第3～14天為0;低劑量治療組僅于給藥后前7 d均有血凝效價(jià),且平均效價(jià)較高,8～14 d為0;而荊防敗毒散治療組與陽性對(duì)照組給藥后第1天的血凝效價(jià)分別為6.4±0.97、9.9±0.74,給藥后第10天的血凝效價(jià)為 6.9±0.74、8.3±0.68,一直持續(xù)較高水平。試驗(yàn)結(jié)束后,采集各試驗(yàn)組活雞的臟器經(jīng)處理后雞胚,96 h后收取尿囊液測(cè)得的效價(jià)均為0。

3.3 給藥后1～14 d采集各試驗(yàn)組雞咽喉及泄殖腔拭子的排毒情況。見表3。

表3 給藥后1～14 d采集各試驗(yàn)組雞咽喉及泄殖腔拭子的排毒情況

4 結(jié)語

由以上結(jié)果可知,將荊防敗毒顆粒按1.5 g/d?只和0.8 g/d?只的劑量飲水給藥對(duì)雞新城疫有很好防治效果,為臨床防治非典型新城疫提供了方法。

[1] 王瑋.中藥抗雞新城疫的臨床試驗(yàn)研究[J].山西農(nóng)業(yè)(畜牧獸醫(yī)),2007,10(1)：21-22

[2] 祝艷華.金絲桃素新制劑在體內(nèi)對(duì) H9N2和H 5N1亞型禽流感病毒抑制作用的研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,蘭州畜牧與獸藥研究所,2006：25.