甘肅棘豆生物堿抑制小鼠肝癌H22的生長(zhǎng)及機(jī)理試驗(yàn)

吳 達(dá),師彥平,張彥明

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌712100;2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所,甘肅蘭州730000;3.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局,甘肅蘭州730020)

甘肅棘豆(Oxytropis Kansuensis Bunge)是豆科棘豆屬植物,其研究已歷經(jīng)百年,在積極探討其防除和綜合利用的同時(shí),大量研究結(jié)果表明,其生物堿部位具有明顯的抗腫瘤活性[1-3]。本試驗(yàn)以荷H 22肝癌腫瘤小鼠為模型,進(jìn)一步研究證實(shí)其抗腫瘤活性;并在細(xì)胞學(xué)水平觀察甘肅棘豆生物堿阻止H 22細(xì)胞惡性表型及直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用,在分子生物學(xué)水平觀察與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、突變型p53蛋白表達(dá)及生物堿的干預(yù)作用,為研究甘肅棘豆生物堿抑制腫瘤活性機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及瘤株 動(dòng)物選用昆明系小鼠,6～8周齡,體重(20±2.0)g,雄性,由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第14-009號(hào);試驗(yàn)環(huán)境：溫度20℃～22℃,相對(duì)濕度45%～50%,環(huán)境設(shè)施合格證：醫(yī)動(dòng)字第14-019號(hào);H 22瘤株購于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。按常規(guī)方法,無菌條件下,選擇生長(zhǎng)良好的H 22,制備成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1.46×106/mL,于小鼠右前腋下接種0.2 mL/只。接種次日,隨機(jī)將接種好的小鼠分成3組,每組為10只。抑瘤試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2 藥物 甘肅棘豆生物堿,于中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所西北天然藥物研發(fā)中心提取,參照預(yù)試驗(yàn)及活性篩選給藥量,配制生物堿試驗(yàn)用劑量為0.25 g/kg,蒸餾水陰性對(duì)照組和生物堿試驗(yàn)組灌胃(ig)給予,接種24 h后開始給藥,給藥量0.2 mL/10 g體重;環(huán)磷酰胺(CTX)：中美合資山西泰盛制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào)011121,臨時(shí)用注射用水配成所需濃度(25 mg/kg),腹腔注射(ip)給藥,每日0.1 mL/10 g體重,給藥10 d。

1.3 試驗(yàn)用品和試驗(yàn)方法 所有動(dòng)物每天給藥1次,連續(xù)10 d。并隔日稱體重1次。停藥次日脫頸處死小鼠,剖取瘤塊,稱瘤重及體重,計(jì)算抑瘤率。

腫瘤抑制率(%)=(1-給藥組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100%

剖取瘤塊,4℃酸性福爾馬林保存,常規(guī)石蠟包埋,切片后行病理檢查(H.E.染色)及PCNA、p53蛋白檢測(cè)(免疫組化SP法)。鼠抗PCNA及p53單克隆抗體均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。免疫組化SP法,具體操作按說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS軟件包作方差分析。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤肉眼觀察及抑瘤率 蒸餾水對(duì)照組瘤塊相對(duì)給藥組和環(huán)磷酰胺組較大,腫瘤有液化并和胸膜甚至肋骨粘連,腫瘤血管豐富,不易剝離,呈擴(kuò)散生長(zhǎng)趨勢(shì);生物堿和環(huán)磷酰胺組瘤塊較小,腫瘤堅(jiān)實(shí),顏色蒼白,易于剝離。生物堿給藥組抑瘤率分別為51.89%、39.84%和46.02%,環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組抑瘤率分別為66.04%、70.31%和75.22%,試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好,各組與對(duì)照組比較差異極顯著(P＜0.001),見表1。

2.2 病理檢查 蒸餾水陰性對(duì)照組小鼠腫瘤切片高倍鏡觀察：腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)簇狀密集生長(zhǎng),排列堅(jiān)實(shí),核較大濃染,形態(tài)各異,異型性明顯,生物堿給藥組和環(huán)磷酰胺組可見大面積紅染無結(jié)構(gòu)的壞死區(qū),腫瘤細(xì)胞明顯減少,殘存腫瘤細(xì)胞大多萎縮,核深染固縮或碎裂迫向死亡,也可見個(gè)別逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞,核明顯縮小,周圍胞漿紅染,核漿比例減小,呈規(guī)則的圓形或橢圓形。組織間有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見中插彩版圖1。

2.3 PCNA表達(dá) PCNA陽性即細(xì)胞核染成棕褐色為陽性反應(yīng),結(jié)果采用PCNA陽性細(xì)胞數(shù)衡量。隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野,計(jì)算每個(gè)高倍鏡視野100個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù),取其平均值作為統(tǒng)計(jì)用結(jié)果。結(jié)果表明,生物堿給藥組和環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組PCNA陽性表達(dá)均較陰性對(duì)照減少(見中插彩版圖2)。各組PCNA表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)見表2,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異極顯著(P＜0.001)。

表1 生物堿對(duì)小鼠H22腫瘤作用結(jié)果

表2 小鼠H22腫瘤細(xì)胞PCNA表達(dá)

2.4 p53蛋白表達(dá) 將所制切片在光學(xué)顯微鏡高倍鏡下觀察,以細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯的棕褐色顆粒狀染色為陽性細(xì)胞,細(xì)胞核藍(lán)染的細(xì)胞為蘇木素復(fù)染的陰性細(xì)胞。免疫組化SP法結(jié)果表明,環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組和甘肅棘豆生物堿組p53陽性細(xì)胞數(shù)均不同程度低于陰性對(duì)照組(P＜0.05),見中插彩版圖3。各組小鼠H 22腫瘤p53表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)見表3。

表3 小鼠H22腫瘤細(xì)胞p53的表達(dá)

3 討論

3.1 甘肅棘豆生物堿對(duì)小鼠H22腫瘤的抑制作用惡性腫瘤是機(jī)體局部組織細(xì)胞在各種內(nèi)部和外界的致癌因子長(zhǎng)期作用下,逐漸發(fā)生持續(xù)性異常增生所形成的新的生長(zhǎng)物或新生物,它是由正常細(xì)胞獲得了新的生物遺傳特性轉(zhuǎn)化而來,具有自主性、去分化性和可移植性。惡性腫瘤常導(dǎo)致局部正常組織結(jié)構(gòu)破壞,組織惡性表型,包括細(xì)胞異型、細(xì)胞核增大、核分裂相、核漿比例增大等[4]。本試驗(yàn)采用H22腫瘤模型,經(jīng)病理切片檢查,蒸餾水陰性對(duì)照組符合癌變特征,但在給予甘肅棘豆生物堿后,情況有所不同,出現(xiàn)大量腫瘤細(xì)胞壞死和惡性表型逆轉(zhuǎn),表明其對(duì)小鼠H 22腫瘤具有明顯的抑制作用。

3.2 PCNA表達(dá)及甘肅棘豆生物堿干預(yù)意義PCNA是存在于細(xì)胞核內(nèi)的一種蛋白質(zhì),即DNA聚合酶δ的輔助蛋白,與DNA的復(fù)制密切相關(guān),它對(duì)細(xì)胞由G1期向S期過度起著重要的調(diào)節(jié)作用,與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[5-6]。本試驗(yàn)蒸餾水陰性對(duì)照組腫瘤細(xì)胞中的PCNA呈高表達(dá),腫瘤細(xì)胞增殖旺盛,而生物堿給藥組PCNA表達(dá)降低,說明甘肅棘豆生物堿可抑制H 22腫瘤細(xì)胞增殖。

3.3 p53蛋白表達(dá)及生物堿干預(yù)意義 p53是53kD的核內(nèi)磷酸蛋白。p53基因突變時(shí),p53蛋白構(gòu)象發(fā)生變化,從而產(chǎn)生積聚并顯示出表達(dá)增強(qiáng),突變型p53在體內(nèi)有較長(zhǎng)的半衰期,免疫組化法可檢測(cè)到陽性表達(dá)。突變型p53不但喪失抑瘤活性,并可能在DNA復(fù)制水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng),是促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及導(dǎo)致增殖異?；钴S的一個(gè)重要因素[7-9]。本試驗(yàn)中,陰性對(duì)照組p53蛋白呈現(xiàn)高表達(dá),生物堿給藥組和環(huán)磷酰胺組腫瘤組織p53蛋白呈現(xiàn)較低表達(dá),說明它們能較好防止腫瘤細(xì)胞中的p53蛋白成為被激活的突變型p53癌基因,從而減緩腫瘤的生長(zhǎng)和惡變。

此外,許多研究認(rèn)為,在組織惡變過程中p53蛋白與PCNA之間存在著密切的正相關(guān)[10-11],作為核內(nèi)轉(zhuǎn)入因子的突變型p53基因由于激活了某些細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)功能,促進(jìn)細(xì)胞增殖,從而使PCNA呈現(xiàn)高表達(dá)。本研究在觀察p53蛋白表達(dá)的同時(shí)也觀察了PCNA的表達(dá),同樣觀察到兩者之間密切而同步的關(guān)系。一方面,PCNA與細(xì)胞增殖相關(guān),惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征之一就在于組織細(xì)胞自主性增殖、生長(zhǎng);而另一方面,p53基因的突變又與組織細(xì)胞惡變有關(guān),因此,在突變型p53基因蛋白表達(dá)與PCNA表達(dá)的兩者之間存在著前后因果的關(guān)系。

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