豬流行性腹瀉診斷方法的研究進展

喻明成，甘振磊，湯德元，李春燕，王 彬，張曉杰，王 鳳，劉志杰

（1.貴州省貴陽市草地生態(tài)畜牧發(fā)展中心，貴州 貴陽 550330；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和食欲下降為主要特征的傳染病。本病有一定的季節(jié)性，多發(fā)生于冬季12 月至第2 年2 月寒冬季節(jié)，但在夏季也可發(fā)生。PED 在各年齡的豬均可感染，傳播迅速，仔豬死亡率高，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。臨床上由于PED 與豬傳染性胃腸炎（TGE）的臨床癥狀極其相似，再加上PED 經(jīng)常與其他腹瀉類疾病混合感染，所以僅憑臨床癥狀來確診PED 較為困難，還需進行實驗室診斷。本文主要針對豬的流行性腹瀉的流行病學(xué)診斷、臨床及病理診斷、病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等進行闡述，為該病的確診提供參考。

1 流行病學(xué)診斷

豬流行性腹瀉發(fā)病有一定的季節(jié)性，多發(fā)生于冬季12 月至第2 年2 月寒冬季節(jié)，但在夏季也可發(fā)生。該病自1971 年首次在英國暴發(fā)以來，相繼在比利時、德國、匈牙利、瑞士等許多歐洲國家也都暴發(fā)了PED。在1978 年英國和比利時首次報道分離得到該病的病毒，確診了PEDV 的感染。隨后，20世紀80 年代，日本、韓國、中國等一些亞洲國家暴發(fā)了豬腹瀉病，經(jīng)熒光抗體試驗和血清中和試驗診斷為PEDV 感染而導(dǎo)致的豬腹瀉。我國于1980 年首次成功分離到PEDV，以后許多地區(qū)均有本病發(fā)生的報道。各種年齡的豬都能感染發(fā)病，哺乳仔豬、斷奶仔豬和育肥豬感染發(fā)病率達100%，成年母豬為15%～90%，其中，1 周齡哺乳仔豬受害最嚴重，病死率平均50%，但有時高達90%，但4～5 周齡的哺乳仔豬病死率不高，尤其是無母源抗體的哺乳仔豬不發(fā)生或僅發(fā)生輕微腹瀉，發(fā)病率和死亡率都很低。另外，癥狀的輕重程度會隨年齡的大小而有差異，年齡越小的，其癥狀表現(xiàn)的越重[1]。1 周齡的哺乳仔豬腹瀉在2～4 d 內(nèi)因脫水而死亡，日齡較大的仔豬約1 周后可康復(fù)。斷奶豬、肥育豬以及母豬常呈現(xiàn)沉郁和厭食癥狀，持續(xù)腹瀉4～7 d，逐漸恢復(fù)正常。成年豬可能只表現(xiàn)沉郁、厭食和嘔吐，一般經(jīng)4～5 d 即可好轉(zhuǎn)。

2 臨床及病理診斷

該病的臨床癥狀主要是發(fā)病豬群都呈黃色水樣腹瀉，體溫基本正常，少數(shù)病豬出現(xiàn)體溫升高l～2 ℃，并帶有惡臭氣味的稀便等特征。本病的潛伏期長短不一，哺乳仔豬8～36 h，育肥豬1～3 d 或可能潛伏時間更長。其臨床癥狀的嚴重程度變化較大，主要取決于豬群免疫力及地方流行性。一般豬通常由拉水樣糞便、嚴重脫水和代謝性酸中毒而引起死亡。哺乳仔豬和育肥豬還表現(xiàn)為嘔吐、精神沉郁、發(fā)病率較高但死亡率低等特點，尤其在育肥后期，大多豬群在7～10 d 后康復(fù)，死亡率只有1%～3%，而這種死亡經(jīng)常在腹瀉的早期，剖檢病死豬常見背部肌肉壞死。應(yīng)激敏感性高的豬群發(fā)生PED 時死亡率更高。該病的臨診癥狀與豬傳染性胃腸炎（TGE）十分相似，但程度較TGE 輕，在同窩豬群中傳播的速度也比TGE 慢得多。解剖豬的腹腔可以觀察到小腸內(nèi)充滿了液體，腸道內(nèi)呈現(xiàn)大量黏樣或水樣糞便，腸體膨脹，小腸壁變薄，腸系膜充血、水腫，淋巴結(jié)水腫，心臟擴張，內(nèi)臟器官淤血。病豬的組織學(xué)變化主要為空腸中后部的小腸絨毛上皮細胞脫落、絨毛變短，但在結(jié)腸，未能觀察到組織病理學(xué)變化。

圖1 小腸絨毛顯著縮短，變得鈍圓。

3 實驗室診斷

豬流行性腹瀉的實驗室診斷方法主要包括病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷法。近幾年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，原位雜交技術(shù)和聚合酶鏈式反應(yīng)診斷技術(shù)因其快速、方便、特異性強、敏感和準確等優(yōu)點已成為實驗室最常用的檢測方法。同時，病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷方法也有了很大的發(fā)展，經(jīng)過不斷的改進和完善，其診斷方法具備了簡單、快速、可重復(fù)性強等特點而被廣泛應(yīng)用于實驗室診斷?，F(xiàn)就以上診斷方法分別敘述如下：

3.1 病原學(xué)診斷

3.1.1 病毒的分離與鑒定

通過采集仔豬空腸及腸內(nèi)容物或刮取空腸及腸內(nèi)容物在青霉素和鏈霉素PBS 液中制成5 倍懸液，然后通過離心取上清液經(jīng)220 nm 微孔濾膜過濾，將濾液接種于Vero 細胞單層上，放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，觀察細胞有無病變。有病變的細胞可見細胞面粗糙，顆粒增多，有多核細胞，細胞逐漸脫落；或?qū)V液感染試驗仔豬，觀察仔豬的病理變化和臨床癥狀，進行回歸動物試驗。如武三孝[2]將試驗仔豬分為A、B、C、D 4 組，A 組是口服加雙抗的腸液（剪右耳做標記）；B 組口服未加雙抗腸液（剪左耳做標記）；C 組口服腸管磨碎物（剪雙耳做標記）；D 組作空白對照組?？诜┝棵拷M均為50 mL 和30 mL 各1 頭，48 h 后觀察臨床癥狀?；貧w動物試驗可驗證所分離的病毒。

3.1.2 免疫電鏡法

一般來說，電鏡法可以有效的作出病原的診斷，可以通過電鏡來觀察病毒的結(jié)構(gòu)、形態(tài)特征及立體構(gòu)型等特點。如將感染豬小腸或病毒細胞培養(yǎng)物制成超薄切片在電鏡下觀察，則可從平面上觀察到病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，形態(tài)大小，復(fù)制方式等。由于TGEV 與PEDV 同屬冠狀病毒，形狀非常相似，在普通電鏡下無法區(qū)別，為此需要用免疫電鏡法（IEM）。IEM 法既可用已知的PEDV 高免血清檢測未知抗原，又可用已知的PEDV 抗原檢測未知抗體。王繼科等[3]把抗原和抗體分別經(jīng)10 000 g/min 離心，免疫復(fù)合物又經(jīng)12 000 g/min 離心，最后在電鏡下直接觀察到典型的病毒粒子形成的免疫復(fù)合物，建立了具有3 次篩選作用的改良的IEM 法，具有簡便、直觀、快速和定性正確等優(yōu)點。但由于需用電鏡設(shè)備，其價格十分的昂貴，一般的實驗室及豬場沒有這樣的條件，不適合于大規(guī)模診斷和臨床診斷。

3.2 血清學(xué)診斷

3.2.1 免疫熒光法

免疫熒光法（IF）一般分為直接免疫熒光法（FAT）、間接免疫熒光法（IFAT）和免疫過氧化物酶技術(shù)，3 種方法都可應(yīng)用于實驗室診斷，但前者較為常用。若IF 或免疫過氧化物酶試驗呈陽性，并伴有腹瀉癥狀，則幾乎肯定為PEDV、。較常用的是直接免疫熒光法（FAT）檢測，是一種比較可靠的特異性診斷方法。在1990 年，崔現(xiàn)蘭等應(yīng)用FAT 檢查病豬小腸的冷凍切片或小腸抹片，對PEDV 人工感染仔豬檢出率為91.4%，電鏡觀察陽性率為47.8%。應(yīng)用間接免疫熒光法(IFAT)對PED 陽性豬血清的檢出陽性率為89%[4]。后來，在1997 年，林志雄等用適用于Vero、PK-15 等傳代細胞株生長繁殖的PEDV-G1 株直接免疫免疫熒光法，用該方法檢測來自有嚴重腹瀉、嘔吐和死亡癥狀的6 個豬場155 份仔豬腸黏膜樣品，檢出率為52%，并用血清中和試驗檢測該6 個豬場的PEDV抗體，證實被PEDV 感染過。同時，應(yīng)用哈爾濱獸研所的熒光抗體方法比較，陽性符合率達95%，陰性符合率90%。并不與豬傳染性胃腸炎病毒、豬細小病毒、輪狀病毒和大腸桿菌等發(fā)生交叉反應(yīng)。證明該方法具有較高的準確性和特異性、。而朱維正等用間接血凝試驗與間接免疫熒光法（IFAT）比較后認為IFAT 法更敏感。

3.2.2 微量血清中和試驗

病毒活毒素與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，失去對易感動物群的致病力，稱之為中和試驗。中和試驗還可以分為兔體中和試驗、熒光抗體病毒中和試驗、過氧化物酶聯(lián)中和試驗等。中和試驗主要用于：1）從待檢血清中檢出抗體，或從病料中檢出病毒，用于診斷病毒性傳染?。?）用抗毒素血清檢查材料中的毒素或鑒定細菌的毒素類型；3）測定抗病毒血清或抗毒素效價；4）新分離病毒的鑒定和分型，中和試驗不僅可在易感的實驗動物體內(nèi)進行，亦可在細胞或雞胚上進行。在1994 年，我國的研究工作者林志雄等[5]建立了PEDV 微量中和試驗。采用適應(yīng)于傳代細胞生長的PEDV-GI株，以PK-l5(豬腎細胞)作為指示細胞，48 h 判定。研究證實本方法檢驗準確、可靠、具有較高的敏感性、可用于流行病學(xué)調(diào)查。

3.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA法）

目前，ELISA 法最大的優(yōu)點就是可從糞便中直接檢查PEDV 抗原，應(yīng)用較為廣泛。但在ELISA 方法出現(xiàn)之前，國外許多學(xué)者都是利用培養(yǎng)病毒的方法直接對PEDV 抗體進行檢測。如1988年Hofmann 等[6]首次報道將PEDV 適應(yīng)于Vero 傳代細胞培養(yǎng)后，對PED 診斷學(xué)方面的研究迅速地有了較大進展，應(yīng)用于PED 及其抗體檢測的診斷試劑制備和檢測方法的建立，但由于PEDV適應(yīng)細胞培養(yǎng)難度大及制備全病毒抗原存在潛在排毒的危險，致使現(xiàn)有的診斷方法僅限于實驗室應(yīng)用階段尚未能大量應(yīng)用于臨床實踐，因而急需一種安全、穩(wěn)定、快速、易于制備且特異性和重復(fù)性均高的新型診斷方法的建立以適用于大批次試樣的檢測。用ELISA 方法檢測PEDV 被大量應(yīng)用于臨床實踐中，該法既可用于測定抗原，也可用于測定抗體，是國際貿(mào)易指定標準診斷方法之一。根據(jù)ELISA 的基本原理，發(fā)展出了雙抗體夾心法ELISA、競爭阻斷ELISA、間接ELISA 以及斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗法（Dot-ELISA 法）等診斷方法。

3.2.3.1 雙抗體夾心法ELISA

該法屬于非競爭結(jié)合測定。它是檢測抗原最常用的ELISA，適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測。朱維正（1988）應(yīng)用雙抗體ELISA 法從腹瀉病豬糞便中直接檢測病毒抗原，首先將特異性抗體包被固相載體上，其次加待檢標本，然后加酶標抗體，使形成固相抗體—待測抗原—酶標抗體夾心復(fù)合物，最后加底物顯色，從而檢測標本中抗原的量。其檢測結(jié)果與電鏡檢查的陽性符合率為97.37%，陰性符合率為100%。

3.2.3.2 競爭阻斷ELISA

該法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可對抗體進行檢測。在國外，如Rodak L 等[7]利 用PEDV M 蛋 白的單克隆抗體建立了敏感性強、特異性高的競爭阻斷ELISA 診斷方法，適于PEDV 流行病學(xué)調(diào)查；Hou 等[8]利用PEDV 重組N 蛋白抗原建立了檢測PEDV 血清的ELISA 方法，為PEDV血清學(xué)監(jiān)測提供手段。Kim O 等[9]建立了單克隆抗體基礎(chǔ)上的免疫組化法，該方法可在福爾馬林固定、石蠟包埋的腸組織中準確而特異的檢出PEDV，可用于鑒別診斷PEDV 與TGEV。

3.2.3.3 間接ELISA

此法是測定抗體最常用的方法，屬非競爭結(jié)合試驗。在國外，Oh 等[10]建立了間接ELISA 診斷方法，與病毒血清中和試驗對比證明，該ELISA 方法具有較高的敏感性和特異性，能用于PEDV 的檢測。國內(nèi)對PEDV 的診斷主要代表有于強等[11]在1987 年用PEDV吉毒株豬胎腸單層細胞培養(yǎng)物，以凍融法制備抗原，建立了間接ELISA 法檢測PED 抗體的方法。對30 份直接免疫熒光證實的PED 病豬群血清測定，97%為陽性，并證實包被板在－20 ℃可保存2 個月。

3.2.3.4 斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（Dot-ELISA）

該方法是在常規(guī)ELISA 方法的使用中不斷進行改進和衍化而來的一種新方法。新測定方法的問世，不僅進一步提高了測定靈敏度、特異性，而且使ELISA 技術(shù)提高了自動化程度，使其應(yīng)用更加簡便、快速。陳茹等[12]在1997年用分離純化的PEDV 抗原，建立斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（Dot-ELISA）檢測豬流行性腹瀉（PED）抗體。采用此方法分別對來自加拿大、中國臺灣省進口的種豬和海南省、廣東省種豬群的血清樣本共834 份進行了檢測，檢測的抗體陽性率達21%。用瓊擴試驗與Dot-ELISA 比較，陰性血清樣品檢測符合率為100%，而陽性血清樣品檢測符合率為31.8%。說明后者更敏感，且該試驗重復(fù)性較好。檢測試劑在4 ℃保存60 d 以及室溫保存30 d，其檢測效果基本一致。

3.3 分子生物學(xué)診斷

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步，在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域為豬的流行性腹瀉的診斷提供了基因分析的多種方法，很多病毒性疾病都可以通過分子生物學(xué)進行有效的診斷，分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有簡單方便、準確性高、特異性強、敏感度高、檢測速度較快等優(yōu)點。目前，許多實驗室診斷都普遍采用是原位雜交技術(shù)（ISH）和聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）2 種方法來檢測PEDV。ISH 是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細胞學(xué)相結(jié)合一種診斷技術(shù)；PCR 是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA 片段，還有限制性內(nèi)切酶譜對病毒特定基因階段及相對應(yīng)的蛋白質(zhì)進行分析，可作出確定的被檢病毒在冠狀病毒屬中的位置。

3.3.1 原位雜交技術(shù)（ISH）

原 位 雜 交 技 術(shù)（in situ hybridization，ISH）是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于20 世紀60 年代。在20 世紀60 末至70 年代初，美國一些專家Gall 和Buongiorno-Nardelli 等 利用同位素標記的核酸基因探針進行了與細胞或組織基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交技術(shù)。原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA 或RNA 互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。為顯示特定的核酸序列必須具備3 個重要條件：組織、細胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補的核苷酸序列（即探針）、有與探針結(jié)合的標記物。Okjin Kim 等[13]利用標記地高辛的核酸探針（0.1 ng/μL）加入的300μL 的標準雜交緩沖液中，在加熱板上95 ℃加熱10 min 后把組織切片放到冰上淬火。大約有50 ng 的地高辛的核酸探針添插到標準雜交緩沖液中（50 μL）。通過一系列的處理后，標記地高辛的核酸探針可以與人工感染仔豬的PEDV 的核衣殼蛋白基因進行堿基互補配對，通過透射電鏡下觀察到仔豬的空腸和結(jié)腸的上皮細胞的胞質(zhì)呈黑色。從而可以證明是PEDV 感染的仔豬腹瀉。該試驗在79 個陽性樣本中檢測出71 個是陽性的，檢出率為91%。另外，該試驗還證明，原位雜交技術(shù)對于檢測福爾馬林溶液固定的組織樣本較為敏感，其檢測效果較好。

3.3.2 PCR 技術(shù)診斷

3.3.2.1 反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(yīng)法（RT-PCR）

在國外比較有代表性的研究工作者有Ishikawa 等[14]根據(jù)S 基因序列設(shè)計了一對可擴增目的片段854 bp 的引物，成功的建立了診斷PEDV 的RT-PCR法，可進行細胞毒和糞便毒的檢測，靈敏度可達100 TCID50/mL，并可在8 h內(nèi)測出。盡管此法敏感性和特異性都很好，但由于對儀器設(shè)備等要求很高，只能適合于實驗室診斷，不能廣泛應(yīng)用于臨床診斷。Kim O 等對免疫組化、原位雜交、RT-PCR 3 種方法進行了比較，認為RT-PCR 法檢測結(jié)果的重復(fù)性最好。如Kubota 等[15]以M 基因和N 基因為靶基因建立了RT-PCR 方法來檢測PEDV，在糞便樣品中能檢測到PEDV 的最低含量為100 TCID50；Song 等建立了鑒別診斷PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（PORV）的多重反轉(zhuǎn)錄PCR（Multi-RT-PCR）為鑒別3 種病毒性腹瀉病原的混合感染提供了技術(shù)支持，同時又建立了檢測PEDV 的實時熒光定量PCR，對仔豬體內(nèi)PEDV 的病毒載量進行了定量；在韓國Kim O 等已建立了TGEV 和PEDV 的二聯(lián)RT-PCR診斷方法，可同時檢測出10TCID50/mL 的TGEV 和PEDV。但當(dāng)被檢樣品為福爾馬林固定時，采用免疫組化和原位雜交這2 種方法更適合。在國內(nèi)，楊群[16]等根據(jù)GenBank 上發(fā)表的豬流行性腹瀉（PEDV）和豬傳染性胃腸炎（TGEV）基因序列，針對其PEDV的M（膜蛋白）基因保守區(qū)及TGEV的S 基因（纖突蛋白基因）5′端保守區(qū)，各設(shè)計一對引物，建立了一種用來檢測PEDV 和TGEV 的多重RT-PCR的方法，同韓國引進的PEDV 和TGEV病毒抗原快速診斷試劑盒檢測結(jié)果相比較，該法具有更好的特異性和敏感性。

3.3.2.2 熒光定量PCR

熒 光 定 量PCR（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。人們主要就是利用PCR 擴增在某一特定擴增時期，擴增產(chǎn)物是指數(shù)增長的，那么最終PCR 產(chǎn)物與模板量直接相關(guān)的這種特點來進行模板定量。PCR 定量關(guān)鍵是選擇好擴增呈指數(shù)增長的最佳時機和內(nèi)部設(shè)置擴增模板對照。由于PCR 定量方法是不斷放大的過程，使原有模板DNA 細小差異也隨之放大。因此PCR 定量技術(shù)與常規(guī)的Southern、Northern 和點印跡雜交定量相比非常敏感。同時要求反應(yīng)條件異常嚴格。該法克服了傳統(tǒng)PCR 易污染、后處理步驟繁雜冗長、缺乏準確定量等缺點，具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，在PEDV 診斷方面也取得了進展。Kim，S-H 等[17]根據(jù)Taq Man 探針熒光定量分析原理，F(xiàn)AM 作為熒光報告基團，Cy5 作為淬滅基團，建立了多重實時熒光定量PCR，為PEDV 和TGEV 病毒載量的檢測提供了技術(shù)手段，其最低檢出量分別為9×101 拷貝/μL 和7×101 拷貝/μL。

3.3.2.3 原位PCR 法（in situ-PCR）原 位PCR 是Hasse 等 于1990 年建立的技術(shù)，原位PCR 技術(shù)是常規(guī)的原位雜交技術(shù)與PCR 技術(shù)的有機結(jié)合，即通過PCR 技術(shù)對靶核酸序列在染色體上或組織細胞內(nèi)進行原位擴增使其拷貝數(shù)增加，然后通過原位雜交技術(shù)進行檢測，從而對靶核酸序列進行定性、定位和定量分析。原位PCR 技術(shù)大大提高了原位雜交技術(shù)的靈敏度和專一性，可用于低拷貝甚至單拷貝的基因定位，是細胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項有較大潛力的新技術(shù)。原位PCR 既能分辨鑒定帶有靶序列的細胞，又能標出靶序列在細胞內(nèi)的位置，對于在分子和細胞水平上研究疾病的發(fā)病機理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實用價值。自建立以來發(fā)展快速，將PCR 技術(shù)與原位雜交技術(shù)結(jié)合起來，既可以檢測低拷貝的DNA 或RNA，又可特異的確定細胞來源和細胞內(nèi)定位。

3.3.2.4 巢式PCR 法（nested-PCR）巢式PCR 是1 種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用2 對PCR 引物擴增完整的片段。第1 對PCR 引物擴增片段和普通PCR 相似。第2 對引物稱為巢式引物（因為他們在第1 次PCR 擴增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第1 次PCR 產(chǎn)物內(nèi)部，使得第2 次PCR 擴增片斷短于第1 次擴增。巢式PCR 的好處在于：如果第1 次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第2 次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR 的擴增非常特異。該法由國外學(xué)者Kim L和Chang K O[18]所發(fā)明設(shè)計，此種方法是針對二者S 基因部分序列的差異性而設(shè)計出來的。反轉(zhuǎn)錄體系引物是針對于PRCV 的S 基因缺失區(qū)而設(shè)計，上游引物和下游引物恰好位于PRCV S 基因缺失區(qū)兩端。這樣對樣品進行RTPCR反應(yīng)結(jié)果是：如果有PEDV的存在，那么產(chǎn)物應(yīng)為陽性，在電泳的泳道上可觀察到與預(yù)先設(shè)計一樣大小的DNA 片段：反之，則為陰性。此外，Kim O 等還建立了鑒別TGEV 和PEDV 的多重巢式RT-PCR 法。此方法適用于檢測福爾馬林固定的組織，以原位雜交法作對照，結(jié)果顯示二者檢出率完全一致。

在研究豬流行性腹瀉的疾病診斷中，近幾年來研究的側(cè)重點主要是ELISA 法和PCR 法，這兩種方法以其實用性強、高效、快速、準確而被廣泛應(yīng)用。尤其是PCR 診斷技術(shù)，比ELISA 法更加敏感，特異性也較強。不過，由于受到儀器設(shè)備的限制，分子生物學(xué)的診斷方法目前還不能適合用于臨床診斷，此法不能得到有效的推廣。但隨著研究的不斷深入，分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景?？傊?，建立一種對傳染病高效、敏感、特異、快速、簡單易用而且廉價的診斷方法有待進一步的研究。

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