CFP10/ESAT6融合蛋白-ELISPOT方法的建立及其在結核分枝桿菌感染診斷中的應用價值*

李嶠珂,吳雪瓊,陽幼榮,梁 艷,張俊仙,李 楠,葉麗萍,梁建琴,王安生,張廣宇,張 濤,王 蘭

100091

2.武警四川省總隊醫(yī)院內一科,樂山 614000;

3.解放軍第三O九醫(yī)院消化科,北京 100091;

4.解放軍第三O九醫(yī)院血液科,北京 100091

目前結核病仍舊是人類所面臨的最嚴重的傳染病之一,早發(fā)現、早診斷、早治療在結核病的防控中就顯得十分重要。目前肺結核患者的診斷主要依據病人臨床表現、影像學檢查以及痰涂片查找抗酸桿菌,而痰涂片的陽性率偏低,分枝桿菌培養(yǎng)一般需4～8w,陽性率也較低;常用的血清學診斷、結核分枝桿菌純蛋白衍生物(PPD)皮膚試驗等輔助診斷方法存在很多不足,如PPD皮膚試驗的靈敏度在活動性肺結核中為 70%～80%,而在播散病例中則低于50%,此外,PPD是多種抗原的混合物,所含的抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌及卡介苗(BCG)所共有,PPD皮膚試驗并不能鑒別結核分枝桿菌感染者和卡介苗接種者、環(huán)境分枝桿菌感染者,因此,PPD皮膚試驗診斷結核感染的靈敏度低,特異性差。目前結核分枝桿菌感染的診斷缺乏金標準。

ELISPOT技術具有高特異度和靈敏度,已被國外廣泛應用于結核分枝桿菌潛伏感染的檢測〔1-4〕。目前英國Oxford Immunotec公司生產的T-SPOT TB試劑盒是應用結核分枝桿菌特異的6 k Da早期分泌性抗原靶(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)多肽刺激結核致敏 T淋巴細胞分泌γ干擾素(IFN-γ),并應用ELISPOT方法檢測分泌IFN-γ的T淋巴細胞〔1〕。本研究應用CFP10/ESAT6融合蛋白作為刺激劑,建立了新的ELISOPT技術檢測結核分枝桿菌感染的方法,檢測健康體檢者、非結核疾病患者和臨床確診的初治結核病患者,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 對象

1.1.1 正常對照組 解放軍第三O九醫(yī)院健康體檢者30例,年齡 18～22歲,平均年齡19.2歲。

1.1.2 非結核疾病組 消化內科及血液科住院病人38例,其中確診為消化道潰瘍 11例,白血病8例,慢性胃炎4例,膽囊炎4例,腸梗阻3例,結腸息肉、消化道腫瘤、再生障礙性貧血和骨髓異常增生綜合征各2例;男性22例,女性16例,年齡19-81歲,平均年齡51.9歲。

1.1.3 結核病組 全軍結核病研究所確診初治結核病40例,其中肺結核27例,肺結核合并胸膜炎8例,肺結核合并腸結核4例,結核性胸膜炎1例;其中18例痰涂片抗酸染色陽性或痰培養(yǎng)結核分枝桿菌陽性,肺結核合并糖尿病3例;男性24例,女性16例,年齡14～72歲,平均年齡37.6歲。

1.2 主要儀器設備及試劑 (1)美國CTL公司酶聯斑點分析儀:由CTL公司中國銷售部提供免費檢測;(2)96孔細胞培養(yǎng)板:美國MILIPOR公司產品;(3)CFP10/ESAT6融合蛋白:由本研究所提供〔5〕;(4)結核菌素純蛋白衍生物(TB-PPD):北京祥瑞生物制品有限公司;(5)鏈親和素-堿性磷酸酶:美國 Promega公司;(6)5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,簡稱BCIP)和硝基藍四氮唑(nitro blue tetrazolium,簡稱NBT)底物:美國Promega公司;(7)人 IFN-γ捕獲抗體和人IFN-γ檢測抗體:美國R﹠D公司;(8)植物血凝素(PHA):美國Sigma公司。

1.3 ELISPOT檢測方法

1.3.1 包被微孔板 每孔加入50μL 1∶60稀釋的IFN-γ捕獲單克隆抗體,4。C冰箱過夜。

1.3.2 外周血單個核細胞分離及計數 取3～4 mL外周抗凝血,用淋巴細胞分層液分離、提純單個核細胞(PBMC),調節(jié)細胞濃度至2.0×106/L。

1.3.3 分泌IFN-γ的T細胞檢測 每個測試樣本需要微孔板4孔:在陰性對照孔內加入完全細胞培養(yǎng)液50μL;在陽性對照孔內加入陽性對照PHA 50μL;在2個測試孔內分別加入CFP10-ESAT6融合蛋白50μL。分別在上述各孔內,加100μL含有2×105個PBMC的懸液,將微量板置于37。C含5%C02孵箱中孵育20h;棄培養(yǎng)上清,用 200μL 1×PBS洗板4次,1min/次;每孔加入 50μL 1∶60稀釋的IFN-γ檢測抗體,37。C孵育2h;洗板后,每孔加入50μL 1∶1 000稀釋的鏈親合素-堿性磷酸酶,室溫孵育 2h;洗板后,每孔加入50μL新鮮配制的BICP/NBT底物,顯色15min;可見板底顯示紫色斑點,用蒸餾水洗板中止反應。每1個點代表1個分泌γ干擾素的T細胞,應用CTL公司酶聯斑點分析儀計數著色的斑點。

1.3.4 結果判斷標準 陰性孔和陽性孔起質控作用,如陰性孔點數＞10,說明可能存在細菌污染;如陽性孔斑點數＜20,說明可能存在細胞數量或活力不足。取PPD皮試陰性的正常人的(檢測孔SFC數-陰性對照孔SFC數)平均值+2s作為陽性判斷標準,因此,當陰性對照孔點數＜8,檢測孔點數減去陰性對照孔點數≥8,可判斷所檢測標本為陽性;如果陰性對照孔點數≥8,檢測孔點數為陰性對照孔兩倍,可判斷所檢測標本為陽性。

1.4 PPD皮膚試驗方法 吸取PPD 0.1mL(5IU),采用曼圖氏法注射于前臂掌側皮內。于注射后72h檢查注射部位反應。若硬結的橫徑及縱徑的平均數≥5mm為陽性。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數資料以率表示,進行χ2檢驗,P＜0.05有統(tǒng)計學意義。兩兩樣本率的比較采用χ2分割法,P＜0.01有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 建立ELISPOT檢測結核分枝桿菌感染的方法 為了研究ELISPOT方法的適宜實驗條件,比較結核病人 1×105、2×105、3×105的 PBMC 經CFP10/ESAT6融合蛋白刺激后分泌IFN-γ的細胞斑點數,結果顯示2×105以上的PBMC可產生理想的細胞斑點;由于應用2×105個細胞數時,結核病患者檢測孔的斑點數足夠多又不很密集,便于計數;而應用3×105個細胞數時,結核病患者檢測孔的斑點數多而密集,不好計數;此外,3×105的PBMC需要抽取更多的外周血,因此確定2×105個PBMC為每孔細胞數。比較PBMC與CFP10/ESAT6融合蛋白共同孵育10h、20h、30h后所產生的分泌IFN-γ的細胞斑點數,結果顯示孵育20h和30h均可獲得滿意的結果;選取2×105個結核病人PBMC,比較PBMC 與 10μg/mL、20μg/mL 、40μg/mL CFP10/ESAT6融合蛋白共同孵育 20h后所產生的分泌IFN-γ的細胞斑點數,結果顯示20μg/mL 和40μg/mL抗原濃度無明顯區(qū)別。因此,本研究確定ELISPOT方法的實驗條件為:PBMC為2×105個,CFP10/ESAT6融合蛋白濃度為 20～40μg/mL,孵育時間為20h。

2.2 應用ELISPOT方法與PPD皮試方法檢測結核感染的結果比較 應用PPD皮試方法及ELISPOT方法檢測108例人血樣本的結果見表1。PPD皮試檢測30例健康體檢者、38例非結核疾病患者和40例結核病患者的陽性率分別為40.0%、0%、72.5%,而ELISPOT檢測的陽性率分別為20.0%、10.5%、92.5%。3組陽性率經列表卡方檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=59.79,P＜0.05)。將各組的陽性率采用χ2分割法檢驗,正常對照組與結核疾病組差異有統(tǒng)計學意義(χ2=38.03,P＜0.01),正常對照組與非結核疾病組差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.20,P＞0.05),結核疾病組與非結核疾病組差異有統(tǒng)計學意義(χ2=52.52,P＜0.01)。將40例結核病患者的ELISPOT檢測結果與PPD皮膚試驗結果進行四格表卡方檢驗(見表2),兩組間檢測結果有顯著性差別(χ2=4.08,P＜0.05)。

表1 應用PPD皮膚試驗和ELISPOT方法檢測108例人血樣本的結果Table 1 The result of 108 samples detected by PPD skin test and ELISPOT

2.3 應用ELISPOT方法與傳統(tǒng)細菌學方法檢測結核病患者的結果比較 將40例結核病患者的ELISPOT檢測結果與痰涂片或痰培養(yǎng)的檢測結果進行四格表卡方檢驗,痰菌陽性組ELISPOT的靈敏度為94.4%,痰菌陰性組ELISPOT的靈敏度為90.9%,兩組間ELISPOT檢測結果無顯著性差異(χ2=0.002,P＞0.05),見表 3。

表2 結核疾病組ELISPOT方法與PPD皮試方法檢測結果的比較Table2 Comparison of 40 TB patients detected by PPD skin test and ELISPOT

表3 結核疾病組ELISPOT檢測與痰菌檢查結果的比較Table3 Comparison of 40 TB patients detected by sputumsmear or-culture and ELISPOT

3 討 論

近年來的研究發(fā)現,ESAT6和CFP10是由RD1區(qū)編碼,該區(qū)只存在于結核分枝桿菌復合群和少數致病性分枝桿菌基因組中,所有卡介苗菌株及大多數非致病性分枝桿菌基因組中均缺乏該區(qū)域〔6-7〕。因此,ESAT-6和CFP-10可作為結核分枝桿菌感染的特異性T細胞刺激抗原。經美國FDA批準上市的T-SPOT TB試劑盒是應用一系列ESAT-6和CFP-10多肽刺激T淋巴細胞分泌γ-干擾素〔3〕,由于一系列多肽合成的費用高,使試劑盒成本和檢測費用增高。Hill等〔4〕的研究表明 ESAT-6/CFP-10融合蛋白作為T淋巴細胞刺激劑可取得同樣的檢測效果,本文采用CFP10/ESAT6融合蛋白進行ELISPOT檢測的結果也證明了這一點,但通過基因工程大量制備重組蛋白的費用卻明顯低于多肽的合成,故本方法極大地降低了檢測的費用。

本試驗用ELISPOT檢測40例臨床已確診結核病患者的靈敏度(92.5%)顯著高于 PPD(72.5%),與 Codecasa等〔8〕的研究結果相似 。國外文獻報道應用ELISPOT方法檢測活動性肺結核的敏感性可達到78%～100%,特異性可達到80%～100%〔9〕,在HIV陽性的結核病患者中其敏感性也可達到90%〔10-11〕。由于結核潛伏感染者的診斷缺乏金標準,無法評價PPD皮膚試驗和ELISPOT的特異性,不能排除ELISPOT陽性而PPD皮膚試驗陰性者為結核潛伏感染者的可能。本文非結核疾病對照組中包括消化系統(tǒng)疾病、血液病和腫瘤患者,以及老年人,可能部分患者由于免疫功能低下,導致PPD皮膚試驗假陰性,而ELISPOT方法不受患者免疫功能的影響,仍可檢測出10.5%的結核潛伏感染者。30例正常對照組的PPD和ELISPOT陽性率分別為40.0%和20.0%,我國第四次全國結核病流行病學調查結果顯示PPD皮膚試驗的陽性率為45.5%〔12〕,與本文相似,而ELISPOT 的陽性率顯著低于PPD皮膚試驗很可能是因為卡介苗接種者被排除了,因此,ELISPOT檢測結果可能反映的是我國真正的結核菌感染率,也就是說,目前我國的結核菌感染者可能并沒有那么多。

我們對痰菌陽性與陰性結核病人的ELISPOT檢測結果分析表明,菌陽和菌陰結核病患者的靈敏度無顯著性區(qū)別,這對于臨床上大部分痰菌陰性的結核病患者及肺外結核病患者的診斷具有重要的實際意義,可作為痰菌陰性結核病輔助診斷的重要方法。另外,ELISPOT在HIV感染者、免疫力低下者、兒童結核和肺外結核的檢測中也可獲得滿意的結果〔13-14〕。

在本試驗的技術操作中應注意一些問題,固相支持物的選擇和準備,試驗過程中細胞的分離和孵育,試驗中試劑的用量,抗體的濃度,劑量及每次作用時間都會造成背景和敏感性的差異,故需建立規(guī)范化的技術標準?？傊?CFP10/ESAT6融合蛋白作為抗原應用于ELISPOT法檢測結核分枝桿菌感染有較高的靈敏度和特異度,可能成為結核分枝桿菌感染的一項重要的篩查工具,并輔助結核病診斷。

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