柔嫩艾美耳球蟲的分離鑒定與致病性測定

王仲兵，古少鵬

（1.山西省動物疫病預防與控制中心，山西太原 030000；2.山西農業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801）

雞球蟲病是由艾美耳球蟲中的一種或幾種寄生于雞腸道黏膜上皮引起的一種寄生性原蟲病[1]，世界各地普遍發(fā)生，是目前養(yǎng)禽業(yè)中危害最大的一種寄生蟲病[2]。目前認為主要有7種禽艾美耳球蟲，即堆型艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲、布什艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲[3]。大多數(shù)球蟲均具有一定的致病性，這使球蟲診斷問題復雜化，而且7種球蟲在卵囊形態(tài)、結構、大小、腸道病變、寄生部位、最短孢子化時間、最短潛伏期等均具有自身特征，它們之間沒有交叉免疫原性，同一宿主可以同時感染幾種球蟲。因此，球蟲卵囊的分離技術是鑒定球蟲的種類和建立球蟲的純種體系，調查某地區(qū)內球蟲種類和獲得球蟲的純種體系的重要手段[4]，對進一步研究球蟲的致病性、藥物效應、產生的耐藥性和禽體對球蟲的免疫性，以及對抗球蟲藥的開發(fā)和球蟲疫苗研制有重要意義[5]。

1 試驗材料

1.1 試驗蟲株

從太谷縣某雞場采集糞便，經實驗室檢查確定含有球蟲卵囊，用飽和鹽水漂浮法分離出球蟲卵囊，作本試驗使用蟲株。

1.2 試驗動物

購自太谷縣韓村種雞場海蘭白公雛，在無球蟲環(huán)境中飼養(yǎng)，飼料經高壓后使用，飲水為清潔涼開水。經糞便檢查，確認無球蟲感染后作為單卵囊分離試驗用動物。

1.3 主要試劑及儀器

主要試劑：飽和食鹽水、重硌酸鉀溶液、等滲溶液、氨水；

主要儀器：電子顯微鏡、離心機、溫箱等。

2 試驗方法

2.1 野毒株的采集及擴增

采集含有球蟲卵囊的雞的糞便，以飽和鹽水漂浮法分離球蟲，經增殖獲得大量混合球蟲卵囊，置2.5%重硌酸鉀溶液保存。

2.2 單卵囊分離試驗

制備1%瓊脂，溶解后澆在培養(yǎng)皿上，厚約1.5 mm，凝固后切成每邊為0.4 cm的小方塊，移至載玻片上。將保存的混合卵囊用等滲溶液稀釋至顯微鏡下觀察每小滴含1~2個球蟲卵囊為止。用毛細滴管將一小滴卵囊液滴于瓊脂塊上，顯微鏡下觀察，當確定液滴內只有一個孢子化的球蟲卵囊時，將一小塊保鮮膜覆蓋于液滴上，經口喂雛雞，并滴入數(shù)滴涼開水，促進其吞咽。

將感染單個卵囊的雞于已消毒環(huán)境中隔離飼養(yǎng)，從感染后96 h逐只檢查糞便，保存含有球蟲的糞便，感染一周后剖殺，取腸內容物鏡檢，發(fā)現(xiàn)卵囊的即為單卵囊后代，收集保存盲腸和糞便中的卵囊。

2.3 卵囊擴增

將單卵囊分離試驗盲腸收集所得的卵囊接種10只11日齡無球蟲小雞，一周后剖殺，收集球蟲，獲得大量純種卵囊。

2.4 蟲種鑒定

將上步所得卵囊感染的雛雞，每日觀察雞的精神狀態(tài)、食欲和最早發(fā)現(xiàn)血便的時間，記錄潛隱期，剖殺后觀察整條腸道，記錄主要病變部位。對收集的純種球蟲卵囊在帶有測微尺的顯微鏡下觀測其形態(tài)結構，測量其長徑、寬經、大小，計算該株卵囊的形狀指數(shù)，并將收集到的純種卵囊保存于重硌酸鉀溶液中，置28℃溫箱培養(yǎng)，記錄其最短孢子化時間，待其孢子化后，在顯微鏡下觀測孢子囊的形態(tài)結構和大小，根據上述各項綜合指標確定蟲種。

2.4 蟲種致病性觀察

將11日齡無球蟲雞，分為7個組，每組9只。分別以1×103個／只、5×103個／只、1×104個／只、2×104個／只、5×104個／只、10×104個／只攻毒，另一組為對照組。接種后每日觀測雞的精神狀態(tài)、飲食欲和血便情況，記錄并剖檢死亡雞。一周后剖殺全部試驗雞，記錄攻毒前體重、剖殺前體重、死亡率、盲腸病變記分和O.P.G值，計算體增重、相對增重率、抗球蟲指數(shù)（ACI）值和半數(shù)感染量（ID50）、半數(shù)致死量（LD50）。

2.4.1 盲腸病變記分參照田角清[6]標準

0：未見病變；

1：盲腸壁有極少量散在出血斑，腸壁增厚，內容物正常；

2：盲腸內有少量血液，腸壁增厚，可見多處出血斑;

3：盲腸內有多量血液，腸壁肥厚，有明顯的盲腸變形和萎縮；

4：盲腸顯著萎縮，病變達直腸部，腸壁極度肥厚，盲腸內有盲腸芯。

若兩側病變不一致，以病變嚴重的一側為準。

2.4.2 ACI值的計算

ACI=（存活率+相對增重率）-（病變記分+卵囊值）[6]

卵囊值：

O.P.G值為0～0.1，卵囊值為0；

O.P.G值為0.1～1，卵囊值為1；

O.P.G值為2～5，卵囊值為10；

O.P.G值為6～10，卵囊值為20；

O.P.G值≥11，卵囊值為40。

O.P.G值為每克糞便中的卵囊數(shù)，以×106為單位。

2.4.3 ID50（半數(shù)感染量）根據血便百分率來計算；LD50（半數(shù)致死量）根據死亡率來計算[7]。

3 試驗結果

3.1 蟲種鑒定結果

感染單卵囊后代的雛雞，感染初期，試驗雞精神、飲食欲無明顯的異常。感染后120 h，感染雞表現(xiàn)為飲食欲減少，羽毛逆立，糞便變稀，個別雞開始拉鮮紅色糞便；135 h開始，每隔兩小時鏡檢一次糞便，到141 h時，第一次從糞便中檢出球蟲卵囊，可見其最短潛隱期為141 h。一周后剖殺，其中兩只雞盲腸高度腫脹和大量出血，黏膜面有大量出血點，腸腔中充滿凝血和腸黏膜碎片，取盲腸內容物和盲腸黏膜刮取物鏡檢可見卵囊，其他腸道無肉眼可見病變，鏡檢內容物中也未見球蟲卵囊，取小腸中段內容物鏡檢，未見裂殖子。因此可確定單卵囊分離所獲得的這株球蟲的裂殖生殖和卵囊寄生部位均在盲腸。用飽和鹽水漂浮法收集糞便和盲腸球蟲卵囊，在顯微鏡下觀察，所收集的球蟲卵囊呈寬卵圓形，卵囊壁為二層，光滑，無卵膜孔，有一圓形極粒位于窄端。用裝有測微尺的顯微鏡測量100個球蟲卵囊，測得的卵囊長徑集中在18.00μm~24.00μm，寬徑集中在15.00μm~21.60μm，將其繪成折線圖（圖 1、圖 2），大小范圍為16.80~28.80μm×14.40~25.20μm，平均大小為 21.54±0.24μm×17.85±0.24μm，形狀指數(shù)為1.21。收集到的球蟲卵囊在28℃的溫箱中培養(yǎng)，檢測的最短孢子化時間為19h，將其孢子化的卵囊置于顯微鏡下觀察，孢子囊有斯氏體，無內外殘體。根據上述觀測結果，參照國內外文獻，可確定該株球蟲為柔嫩艾美耳球蟲，并命名為E.t SX01323。

3.2 柔嫩艾美耳球蟲致病性試驗

感染初期，試驗雞精神、飲食欲無明顯的異常。感染4天后，6個實驗組雞均表現(xiàn)為飲食欲減少，羽毛逆立，糞便變稀，感染后第5天，雞群出現(xiàn)糞便帶血，精神倦怠，雙翅下垂，臥地弓背或尾羽上撅，肛門周圍和后覆尾羽粘有紅褐色血性糞便。并有部分雞只死亡，隨感染劑量增加死亡率也相對增高。剖檢病死雞，可見盲腸壁增厚、腫脹、出血，腸腔中充滿凝血塊和盲腸粘膜碎片及干涸的盲腸芯。肉眼觀察其他腸段無明顯變化。

除對照組外，各感染組雛雞，卵囊排出量和血便量隨攻毒量增大而增多，其半數(shù)感染量為0.99×104個／只；相對增重率、ACI值隨攻毒量的增加而減小，攻毒量由1×103增到10×104個／只時，雛雞相對增重率由55.27%降到了29.28%，可見柔嫩艾美耳球蟲對雛雞增重的影響很大，且劑量越大，對增重的影響越大，對照組雛雞的ACI值為200，而感染雛雞在 1×103~2×104個／只范圍內，ACI值在 152.81±1.33~100.45±0.70范圍內，可反映出柔嫩艾美耳球蟲對雛雞的損傷較輕微，感染量在5×104~10×104個／只范圍內，雛雞的ACI值降到了76.99±2.15~55.63±1.18范圍內，此時柔嫩艾美耳球蟲對雛雞的損傷已較嚴重，可見柔嫩艾美耳球蟲對雛雞ACI值的影響也很大，且隨著劑量增大，對ACI值的影響越來越大；雛雞的攻毒量在5×103個／只以內不引起死亡，攻毒量在1×104個／只以上，死亡率隨攻毒量增加而增高，其半數(shù)致死量為7.52×104個/只；試驗各感染組病理剖檢均觀察到不同程度的腸道病變，隨著感染劑量的增加，病變程度越來越嚴重，當攻毒量在1×103~5×103個／只以內時，雛雞盲腸壁見少量散在出血點，內容物中有少量血液，攻毒量在1×104~10×104個／只以內，盲腸高度腫脹，腸腔內充滿凝血和脫落腸黏膜。結果見表1、2和圖3、4。

4 分析與討論

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球蟲分布范圍廣，危害大，嚴重威脅養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，球蟲病對于雛雞而言，常常是毀滅性的[8]。其中，致病力最強的為柔嫩艾美爾球蟲（E．tenella）和毒害艾美爾球蟲（E．nacatrix），每年給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的損失。因此，許多學者致力于球蟲方面的研究。要想深入研究每一種球蟲的特性就需要提取品種單一的球蟲卵囊進行研究；同時生物技術的進步為球蟲的活苗，基因工程苗[9]及球蟲遺傳變異的研究提供了更為廣闊的空間，而獲得品種單一、基因型純凈的球蟲卵囊是這些研究能否順利進行的前提。目前，球蟲單卵囊分離技術是獲得球蟲純種體系的重要手段[10]，是上述各種研究的基礎。

柔嫩艾美耳球蟲（E．tenella）顯著的特征是寄生于盲腸和臨床上出現(xiàn)明顯的血便，本實驗分離純化的這株球蟲具有此特征，在顯微鏡下其卵囊結構、測得的卵囊和孢子囊大小、卵囊形狀指數(shù)、潛隱期和最短孢子化時間均為柔嫩艾美耳球蟲的特征，且在小腸中段亦未見到裂殖子。因此，鑒定分離所的這株純種球蟲為柔嫩艾美耳球蟲（E．tenella）。

本實驗通過設計劑量梯度對所分離出的柔嫩艾美耳球蟲進行致病性觀察，無論從攻毒劑量，還是檢測指標（增重率、盲腸病變、ACI值、半數(shù)感染量、半數(shù)致死量）均可得出該株柔嫩艾美耳球蟲的毒力很強，應該引起人們足夠的重視。且該株柔嫩艾美耳球蟲可供以后柔嫩艾美耳球蟲的進一步深入研究。

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