不同頻率沖擊波促進(jìn)兔管狀骨成骨的實(shí)驗(yàn)研究

張繼英 侯宇 薛濤 段小寧 傅欣 田明 于長(zhǎng)隆

北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所（北京100191）

沖擊波是機(jī)械波以超音速傳播時(shí)，引起遞質(zhì)急劇強(qiáng)烈壓縮的過(guò)程，可以使遞質(zhì)正相壓力在極短的時(shí)間內(nèi)從環(huán)境壓上升至最大壓力，再迅速下降[1]。體外沖擊波療法（extracorporeal shock wave therapy，ESWT）是利用能量轉(zhuǎn)換和傳遞原理，造成不同密度組織之間產(chǎn)生能量梯度差及扭拉力，并形成空化效應(yīng)，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。該療法已廣泛應(yīng)用于治療疲勞性骨折[2，3]、骨不愈合[4-6]，效果肯定。但沖擊波促進(jìn)成骨的變化過(guò)程，不同頻率沖擊波對(duì)管狀骨骨膜、骨皮質(zhì)作用仍未見(jiàn)報(bào)道。本研究以新西蘭大白兔為研究對(duì)象，對(duì)兔脛骨中段外側(cè)施以不同頻率的沖擊波處理，觀察不同頻率的沖擊波對(duì)正常骨膜及骨皮質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及沖擊波治療儀:39只（78例后肢）健康雄性新西蘭大白兔由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。4月齡，體重2.15～2.5kg，在普通級(jí)條件下飼養(yǎng)。3只為正常對(duì)照組，36只為實(shí)驗(yàn)組。沖擊波治療儀（shock wave therapy instrument） 生產(chǎn)廠家為 ElectroMedical System—SWISS DOLORCLAST。

1.2 沖擊波處理:實(shí)驗(yàn)組36只大白兔，隨機(jī)平均分為3組，每組12只。氯胺酮1ml肌注麻醉，其中一組后肢脛骨中段外側(cè)給予4Hz沖擊波處理，共2000次；另一組后肢相同部位給予7Hz沖擊波處理，共2000次；最后一組后肢相同部位給予15Hz沖擊波處理，共2000次。術(shù)后普通飲食，自由活動(dòng)。

1.3 取材與標(biāo)本處理:沖擊波處理后3天每組處死6只，7天處死剩余6只，對(duì)照組選取1只3天處死，7天處死剩余2只。取雙側(cè)脛骨中上1/3部分，生理鹽水沖洗后，4%多聚甲醛固定，甲醛－甲酸脫鈣，脫鈣完全后，自來(lái)水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋后連續(xù)切片，厚度為5μm，50℃蒸餾水中展片，撈片于涂有蛋白甘油的載玻片上，50℃烘箱內(nèi)烤片備用。

1.4 蘇木精－伊紅染色:組織切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化到自來(lái)水，蒸餾水沖洗；蘇木精染色2min，分化，返藍(lán)，自來(lái)水沖洗；蒸餾水沖洗后伊紅染色1min，自來(lái)水沖洗；脫水上行至二甲苯，中性樹(shù)膠封片。

1.5 甲苯胺藍(lán)染色:組織切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化到自來(lái)水，蒸餾水沖洗；0.5%甲苯胺藍(lán)染色5min，自來(lái)水沖洗；脫水上行至二甲苯，中性樹(shù)膠封片。

1.6 主要觀察指標(biāo)

1.6.1 組織學(xué)變化:通過(guò)HE染色和甲苯胺藍(lán)染色觀察骨膜和骨皮質(zhì)的組織學(xué)變化。

1.6.2 骨膜生發(fā)層細(xì)胞計(jì)數(shù):切片HE染色后，在200倍光鏡（OLYMPUS BX51 Japan）下選取骨膜生發(fā)層細(xì)胞最多的視野6張，計(jì)數(shù)6個(gè)視野內(nèi)骨膜生發(fā)層細(xì)胞與正常骨膜生發(fā)層細(xì)胞相比增加的百分?jǐn)?shù)。

1.6.3 骨膜生發(fā)層厚度測(cè)量:切片HE染色后，在200倍光鏡（OLYMPUS BX51 Japan）下隨機(jī)選取自外骨膜纖維層至骨皮質(zhì)的視野6張，Micro-Image v4.5 imaging software計(jì)數(shù)6個(gè)視野內(nèi)骨膜生發(fā)層厚度。

1.6.4 髓腔開(kāi)放程度測(cè)量:切片HE染色后，在200倍光鏡（OLYMPUS BX51 Japan）下隨機(jī)選取骨皮質(zhì)緊貼外骨膜生發(fā)層的視野6張，MicroImage v4.5 imaging software計(jì)數(shù)6個(gè)視野內(nèi)非骨組織面積百分比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:各組數(shù)值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組比較采用秩和檢驗(yàn)，P<0.01為具有顯著性差別。

2 結(jié)果

2.1 骨膜和骨皮質(zhì)組織學(xué)變化（圖1、2）

2.1.1 沖擊波處理后3天

對(duì)照組:骨膜組織未見(jiàn)出血，外骨膜生發(fā)層薄，外骨膜纖維層纖維組織密集排列；可見(jiàn)骨皮質(zhì)，骨髓腔未見(jiàn)開(kāi)放，內(nèi)骨膜未見(jiàn)明顯變化，骨膜及骨皮質(zhì)均未見(jiàn)甲苯胺藍(lán)陽(yáng)性染色。

4Hz、7Hz實(shí)驗(yàn)組:骨膜組織有大量出血，可見(jiàn)骨膜生發(fā)層及纖維層均有紅細(xì)胞出現(xiàn)，外骨膜生發(fā)層增厚，細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞核呈圓形者居多，外骨膜纖維層纖維組織密集排列；可見(jiàn)骨皮質(zhì)增厚，骨髓腔開(kāi)放，髓腔內(nèi)細(xì)胞增生，外骨膜向內(nèi)長(zhǎng)入，與髓腔相通，內(nèi)骨膜未見(jiàn)明顯變化，骨膜及骨皮質(zhì)均未見(jiàn)甲苯胺藍(lán)陽(yáng)性染色。

15Hz實(shí)驗(yàn)組:骨膜組織有出血，可見(jiàn)骨膜生發(fā)層及纖維層有少量紅細(xì)胞出現(xiàn)，外骨膜生發(fā)層增厚，細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞核呈圓形者居多，外骨膜纖維層纖維組織密集排列，骨髓腔未見(jiàn)開(kāi)放，髓腔內(nèi)細(xì)胞增生，內(nèi)骨膜未見(jiàn)明顯變化，骨膜及骨皮質(zhì)均未見(jiàn)甲苯胺藍(lán)陽(yáng)性染色。

2.1.2 沖擊波處理后7天

對(duì)照組:骨膜組織未見(jiàn)出血，外骨膜生發(fā)層薄，外骨膜纖維層纖維組織密集排列；可見(jiàn)骨皮質(zhì)，骨髓腔未見(jiàn)開(kāi)放，內(nèi)骨膜未見(jiàn)明顯變化，骨膜及骨皮質(zhì)均未見(jiàn)甲苯胺藍(lán)陽(yáng)性染色。

4Hz處理組:骨膜組織仍有少量出血，可見(jiàn)紅細(xì)胞；骨膜生發(fā)層增厚，細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞核呈圓形者居多，骨膜纖維層纖維組織疏松排列，外骨膜與髓腔相通，髓腔內(nèi)細(xì)胞增生，內(nèi)骨膜仍未見(jiàn)變化，骨膜及骨皮質(zhì)均未見(jiàn)甲苯胺藍(lán)陽(yáng)性染色。

7Hz處理組:骨膜組織出血基本消失，紅細(xì)胞少；骨膜生發(fā)層增厚，細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞核呈圓形者居多，骨膜纖維層纖維組織疏松排列，外骨膜與髓腔相通，髓腔開(kāi)放程度遠(yuǎn)高于15Hz組，但與4Hz組無(wú)明顯差異，髓腔內(nèi)細(xì)胞增生，內(nèi)骨膜仍未見(jiàn)變化，骨膜及骨皮質(zhì)均未見(jiàn)甲苯胺藍(lán)陽(yáng)性染色。

15Hz處理組:骨膜組織仍有出血，可見(jiàn)紅細(xì)胞；骨膜生發(fā)層增厚，細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞核呈圓形者居多，骨膜纖維層纖維組織疏松排列，外骨膜與髓腔未見(jiàn)相通，內(nèi)骨膜仍未見(jiàn)變化，骨膜及骨皮質(zhì)均未見(jiàn)甲苯胺藍(lán)陽(yáng)性染色。

2.2 骨膜生發(fā)層細(xì)胞計(jì)數(shù)（圖3）

沖擊波處理3天后，骨膜生發(fā)層細(xì)胞明顯增多，對(duì)照組 :100.3±5.8% ；4Hz 組 :251.3±11.5% ；7Hz 組 :272±13.2%；15Hz組:256±8.2%。沖擊波處理后7天，生發(fā)層細(xì)胞比處理后3天顯著增多，但密度下降。對(duì)照組:101.2±6.3%；4Hz 組:601.3±11.5%；7Hz 組 :602±83.2%，15Hz組:510±73.2%。4Hz、7Hz實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量顯著多于15Hz實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。

2.3 骨膜生發(fā)層厚度（圖4）

沖擊波處理3天后，骨膜生發(fā)層增厚，4Hz組:8.2±1.3μm；7Hz組:8.0±1.1μm；15Hz組:8.2±0.97μm。沖擊波處理7天后，骨膜生發(fā)層顯著增厚，4Hz組:20.4±1.3μm；7Hz組:34.5±3.2μm；15Hz組:14.1±3.6μm。

沖擊波處理3天，不同實(shí)驗(yàn)組骨膜生發(fā)層厚度無(wú)顯著差異；沖擊波處理7天，4Hz、15Hz組骨膜生發(fā)層厚度顯著低于7Hz組。

沖擊波處理3天后，髓腔均有開(kāi)放，4Hz組:37%±13.6%；7Hz:45±11.6%，15Hz:33±9.6%；沖擊波處理 7天后，4Hz組:55%±12.3%；7Hz組:92±10.6%，15Hz組:46±12.2%；沖擊波處理后，7Hz組髓腔開(kāi)放程度顯著高于4Hz組和15Hz組。

3 討論

體外沖擊波被廣泛應(yīng)用于骨延遲愈合與骨不愈合[7，8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沖擊波促進(jìn)骨膜生發(fā)層增生，骨皮質(zhì)增厚，髓腔開(kāi)放，外骨膜與髓腔相通，而內(nèi)骨膜無(wú)明顯變化；4Hz和7Hz實(shí)驗(yàn)組骨膜生發(fā)層細(xì)胞數(shù)量、髓腔開(kāi)放程度均高于15Hz實(shí)驗(yàn)組；15Hz沖擊波處理后3天髓腔輕度開(kāi)放，處理后7天髓腔開(kāi)放程度降低。

本研究觀察到，正常脛骨中段經(jīng)過(guò)不同頻率沖擊波沖擊后均有外骨膜出血增厚，骨髓腔開(kāi)放并纖維化，可以見(jiàn)到成骨樣細(xì)胞增生，出現(xiàn)典型的骨膜成骨改變，說(shuō)明骨膜組織增生成骨主要依靠:（1）外骨膜生發(fā)層成骨樣細(xì)胞增生；（2）骨皮質(zhì)增厚，髓腔內(nèi)成骨樣細(xì)胞增生，髓腔開(kāi)放；（3）外骨膜生發(fā)層與髓腔相通，骨髓纖維化，髓腔內(nèi)增生組織與外骨膜生發(fā)層組織融合。骨折延遲愈合，肥大性骨折不愈合，較小的骨缺損，存在較多的骨膜組織，沖擊波治療可以促進(jìn)外骨膜生發(fā)層與髓腔內(nèi)成骨樣細(xì)胞增生，填充缺損，促進(jìn)愈合；對(duì)于較大的骨缺損，沖擊波治療雖然可以促進(jìn)成骨樣細(xì)胞增生，但是并不足以填充缺損；對(duì)于萎縮型骨折不愈合，沖擊波治療可能無(wú)法促進(jìn)髓腔內(nèi)增生組織與外骨膜生發(fā)層組織融合，因此單純沖擊波治療療效不佳，目前多采用手術(shù)結(jié)合沖擊波治療[9]。

本研究結(jié)果顯示，沖擊波處理7天組骨髓腔開(kāi)放及纖維化程度改變要比3天組更為明顯。Montero等[10]研究發(fā)現(xiàn)500次及以上的沖擊波可以造成外骨膜分離，骨皮質(zhì)微骨折，低于500次的沖擊波未見(jiàn)到變化。這說(shuō)明沖擊波促進(jìn)成骨存在劑量效應(yīng)，在使用過(guò)程中需選擇合適的劑量。

本研究中，正常脛骨中段經(jīng)過(guò)不同頻率沖擊波沖擊后出現(xiàn)典型的骨膜成骨的改變，所有實(shí)驗(yàn)組骨膜及骨皮質(zhì)均未見(jiàn)甲苯胺藍(lán)陽(yáng)性染色，未見(jiàn)軟骨形成。骨折愈合過(guò)程中有兩種成骨方式，即膜內(nèi)化骨及軟骨內(nèi)化骨。由骨膜增生、鈣化成骨的過(guò)程稱(chēng)為膜內(nèi)化骨。骨折斷端及髓腔內(nèi)的血腫形成血凝塊，歷經(jīng)肉芽組織、纖維組織、軟骨組織，最終轉(zhuǎn)變?yōu)楣墙M織，稱(chēng)為軟骨內(nèi)化骨。本研究中所有實(shí)驗(yàn)組未見(jiàn)軟骨形成，說(shuō)明沖擊波是通過(guò)外骨膜膜內(nèi)化骨促進(jìn)成骨，不經(jīng)過(guò)軟骨化骨的過(guò)程。外骨膜由纖維的膜性結(jié)構(gòu)和含有成骨細(xì)胞的生發(fā)層組成。本研究結(jié)果表明適當(dāng)頻率的沖擊波促進(jìn)外骨膜生發(fā)層細(xì)胞增生，增強(qiáng)了外骨膜的成骨作用；對(duì)應(yīng)部位骨髓腔開(kāi)放，髓腔纖維化，向成骨方向發(fā)展，應(yīng)該是外骨膜成骨誘導(dǎo)作用的表現(xiàn)；外骨膜纖維層作為一種特殊的膜，能夠阻擋成纖維細(xì)胞進(jìn)入到骨膜生發(fā)層，使骨質(zhì)形成免受周?chē)浗M織侵犯，為目的細(xì)胞的進(jìn)入、增殖創(chuàng)造良好的條件，具有引導(dǎo)和限制組織再生的作用。本研究中各實(shí)驗(yàn)組均可見(jiàn)到外骨膜纖維層纖維組織密集排列，形態(tài)完整，說(shuō)明沖擊波未破壞外骨膜纖維層，未影響誘導(dǎo)作用。沖擊波增強(qiáng)了外骨膜的成骨及誘導(dǎo)成骨的雙重作用，

本研究結(jié)果顯示，沖擊波可造成外骨膜組織與髓腔內(nèi)成骨樣細(xì)胞增生，而內(nèi)骨膜無(wú)明顯變化。Montero等[10]研究發(fā)現(xiàn)500次及以上的沖擊波可以造成外骨膜分離，骨皮質(zhì)微骨折，但沒(méi)有觀察到明顯的骨折線，但是本實(shí)驗(yàn)未觀察到外骨膜分離，骨皮質(zhì)微骨折的現(xiàn)象。王五洲等[11]對(duì)新西蘭種兔肢體實(shí)施體外沖擊波治療，取骨膜組織進(jìn)行體外培養(yǎng)和3H-TdR滲入放射自顯影研究。結(jié)果表明，沖擊波治療后1～2周，實(shí)驗(yàn)側(cè)骨膜組織3H-TdR標(biāo)記率為對(duì)照側(cè)的2倍，表明沖擊波加速了DNA的復(fù)制，促進(jìn)了骨膜成骨細(xì)胞的增殖，因而骨膜成骨作用加強(qiáng)，加速創(chuàng)傷后骨折愈合，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。沖擊波促進(jìn)外骨膜與髓腔內(nèi)成骨樣細(xì)胞增生的原因可能是:（1）通過(guò)應(yīng)力效應(yīng)造成骨膜的微損傷，沖擊波引起組織細(xì)胞的拉伸，組織間松解，細(xì)胞的彈性變形，活化了細(xì)胞，激活細(xì)胞的增殖，促進(jìn)骨痂生成，實(shí)現(xiàn)骨愈合；（2）沖擊波的脈沖尾部的負(fù)向波段壓可引起空化效應(yīng)（Cavitation）[12]。當(dāng)流體動(dòng)力場(chǎng)所受的壓力低于液體的飽和汽壓時(shí)，液體中的分子就會(huì)進(jìn)入空化反應(yīng)核（微小氣泡），并使其膨脹，變成可以觀測(cè)到的大小，這就是空化效應(yīng)?？栈?yīng)可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生刺激，改善微循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)未觀察到內(nèi)骨膜明顯變化，可能有兩個(gè)原因:（1）應(yīng)用沖擊波治療時(shí)，沖擊波在由軟組織傳入骨組織時(shí)，會(huì)產(chǎn)生反射和折射，對(duì)骨膜組織及周?chē)M織產(chǎn)生較大的影響[2，13]；（2）沖擊波前沿的尖峰部分主要由高頻波組成，其余部分則由低頻波組成。高頻波的聚焦性能較強(qiáng)，焦點(diǎn)的能量密度高，但對(duì)組織的穿透能力差；而低頻波對(duì)組織的穿透能力較強(qiáng)，但聚焦性能差，焦點(diǎn)的能量密度低[12]。沖擊波經(jīng)過(guò)外骨膜、骨皮質(zhì)，抵達(dá)內(nèi)骨膜時(shí)，高頻波能量大幅衰減，對(duì)內(nèi)骨膜影響低；而低頻波穿透能力強(qiáng)，能量密度低，對(duì)內(nèi)骨膜作用小[14]。Kojimoto等[15]行兔脛骨截骨后骨痂延長(zhǎng)術(shù)，通過(guò)X線片及組織學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)去除外骨膜后骨痂形成明顯受到干擾，骨質(zhì)無(wú)法延長(zhǎng)；與之相反，去除內(nèi)骨膜后，對(duì)骨及骨痂形成并沒(méi)有明顯影響。這說(shuō)明骨外膜對(duì)骨折愈合的影響大于骨內(nèi)膜，在骨折愈合過(guò)程中起到主要作用。

本研究結(jié)果表明，不同頻率沖擊波促進(jìn)管狀骨成骨的能力不同。4Hz、7Hz實(shí)驗(yàn)組骨膜生發(fā)層細(xì)胞數(shù)量、髓腔開(kāi)放程度均高于15Hz實(shí)驗(yàn)組，這可能是由于高頻率沖擊波能量主要分布于外骨膜，對(duì)骨皮質(zhì)及髓腔影響不足，且空化效應(yīng)較強(qiáng)，造成損傷過(guò)度。所以在應(yīng)用沖擊波治療時(shí)需選用恰當(dāng)?shù)念l率。

本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新點(diǎn)在于:（1）觀察了沖擊波促進(jìn)成骨的早期病理變化過(guò)程，發(fā)現(xiàn)沖擊波促進(jìn)外骨膜生發(fā)層組織增生、髓腔開(kāi)放、骨髓纖維化，髓腔內(nèi)增生組織與外骨膜增生組織融合，而未見(jiàn)軟骨形成；（2）發(fā)現(xiàn)不同頻率的沖擊波作用不同，較低頻率沖擊波（7Hz，4Hz）對(duì)管狀骨骨膜及骨皮質(zhì)影響大于較高頻率沖擊波（15Hz），提示應(yīng)用沖擊波治療時(shí)需選用恰當(dāng)?shù)念l率。

需要指出，本實(shí)驗(yàn)不是研究沖擊波對(duì)骨的延遲愈合或不愈合的作用，其結(jié)論不一定適用于沖擊波對(duì)骨不愈合或延遲愈合的治療。在病理?xiàng)l件下外骨膜與骨皮質(zhì)反應(yīng)可能有不同。此外，本研究也僅觀察了沖擊波處理早期骨膜及骨皮質(zhì)的病理變化。

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