耐力訓(xùn)練對(duì)衰老小鼠心肌Akt/mTOR信號(hào)通路的影響

李欣 丁樹哲 盧健

1華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院（上海 200241）

2綿陽師范學(xué)院體育與健康教育學(xué)院（四川綿陽 621000）

心肌sarcopenia是一種隨年齡增加而出現(xiàn)的心肌細(xì)胞減少和心血管功能減退的一種老年病征[1]。其主要特征為心肌細(xì)胞數(shù)量減少、剩余心肌細(xì)胞代償性肥大、以左心室變化為主的心血管功能的減退[1]。衰老心肌細(xì)胞有從生理性的代償性肥大向病理性的失代償性肥大發(fā)展的趨勢(shì)[2]，是發(fā)生心肌 sarcopenia 的重要機(jī)制之一[1]。最能區(qū)分生理性和病理性心臟肥大的特征性信號(hào)通路是Gaq和PI3-K信號(hào)通路，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路主要在生理性代償性肥大過程中起到主導(dǎo)地位，在心肌向病理性肥大轉(zhuǎn)化過程中，該信號(hào)通路表達(dá)降低[3]。目前的研究證實(shí)運(yùn)動(dòng)可以通過對(duì)該通路的影響來正性對(duì)抗心肌細(xì)胞向病理性肥大轉(zhuǎn)化的表型[4]，但關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老心臟PI3K/Ak/mTOR信號(hào)通路的研究較少，其作用機(jī)制仍不清楚。本研究通過建立衰老小鼠耐力訓(xùn)練模型，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)觀察耐力訓(xùn)練后衰老小鼠心肌Akt/mTOR通路中 Akt、mTOR、p70S6K和eIF-4E基因表達(dá)的變化，探討耐力訓(xùn)練對(duì)衰老心臟Akt/mTOR信號(hào)通路的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SAMP8小鼠36只（由天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):W-J津?qū)崉?dòng)質(zhì)M準(zhǔn)字第006號(hào)，2月齡），體重為17.98±0.82g。實(shí)驗(yàn)在華東師范大學(xué)運(yùn)動(dòng)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，室溫20～22℃，相對(duì)濕度45～50%，晝夜節(jié)律人工控制光照，光照時(shí)間為12h/d。小鼠按體重分層后隨機(jī)分為年輕對(duì)照組（young control group，YC組）、耐力訓(xùn)練組（endurance training group，E組）和老年對(duì)照組（aging control group，AC組），每組 12只。各組均以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料（由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）飼養(yǎng)，自由取食及飲水。每周觀察小鼠的一般狀況，測(cè)量飲食量和體重，用以監(jiān)控建模過程。

1.2 運(yùn)動(dòng)模型建立

YC組飼養(yǎng)至3月齡時(shí)處死；在Reznick研究基礎(chǔ)上[5]，結(jié)合 Fernando 的運(yùn)動(dòng)模型[6]，E 組小鼠在 DSPT～202型電動(dòng)鼠類跑臺(tái)上進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練1個(gè)月，每周5次，每次訓(xùn)練20min，速度為10m/min。正式跑臺(tái)訓(xùn)練從3月齡開始，每周3次，每次40min，包括5m/min的熱身（5min），15m/min的耐力訓(xùn)練（30min），5m/min的放松（5min），持續(xù)訓(xùn)練3個(gè)月。訓(xùn)練在晚上18點(diǎn)到20點(diǎn)間進(jìn)行，不使用光、電等刺激手段，訓(xùn)練至6月齡時(shí)處死；AC組小鼠也同時(shí)在此環(huán)境中自由活動(dòng)，飼養(yǎng)至6月齡，到達(dá)衰老時(shí)處死。

1.3 實(shí)驗(yàn)取材及組織準(zhǔn)備

動(dòng)物建模結(jié)束后24小時(shí)內(nèi)，每組隨機(jī)選取4只小鼠，0.4%戊巴比妥鈉0.3ml腹腔麻醉后，開胸暴露心臟，針頭從心尖部插入左心室后快速滴注肝素化的生理鹽水（500ml生理鹽水中含有肝素2ml），剪斷后腔靜脈，滴完生理鹽水后，再快速滴注4%的多聚甲醛緩沖鹽溶液500ml。常規(guī)酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，切片，切片厚度為 5μm，放入 37℃恒溫箱烤干，待用。其余小鼠斷頭處死后取出心臟修剪，將心臟沿冠狀面切開，濾紙吸干心臟表面的液體后稱重，計(jì)算心系數(shù)（心系數(shù)=心臟重量/體重）；固定液中固定24h后，用錫箔紙包裹、標(biāo)記后放入液氮中，于-80℃低溫冰箱保存待用。

1.4 總mRNA提取及RT-PCR

取心臟組織塊50～100g，用液氮在研缽中加Trizol研磨成粉末狀后移入離心管中，冰上孵育5分鐘后加0.2ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘后 12000g，4℃離心15分鐘，取上清液移至新離心管，加0.5ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘后12000g，4℃離心10分鐘，棄上清液，加入1ml 75%乙醇，震蕩后7500g，4℃離心5分鐘，棄上清液后室溫下使之干燥，加入DEPC處理水10μl溶解RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性后，使用RT-PCR，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA待用。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Farmentas MBI），并按試劑盒說明書進(jìn)行操作。加4μl RNA樣品于冰上放置的 EP管中，1μl的 oligo（dT），加無菌無酶水至總體積為 12μl?；靹蚝箅x心 5s，70℃溫浴 5min，再于冰上按 順 序 加 入 :4μl5 ×buffer，1μlRNasin（20U/μl），2μl 10mMdNTP mix?；靹蚝蠖虝弘x心。37℃孵育。加 1μl的M-MLV（200U/μl），至反應(yīng)終體積為 20μl。42℃孵育 1h，70℃溫浴10min，冰上放置。產(chǎn)物-20℃保存。

1.5 設(shè)計(jì)合成引物

從美國(guó)國(guó)家生物信息中心的序列資料庫(kù)（Gene Bank）查找小鼠 Akt、mTOR、p70S6K、eIF-4E（目的基因）及小鼠 β-肌動(dòng)蛋白（β-actin，內(nèi)參照）基因序列，應(yīng)用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海捷瑞生物公司合成（表1）。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物序列及相關(guān)參數(shù)Table 1 Sequence of primer and its related parameters

1.6 Real-Time PCR反應(yīng)

Applied Biosystems StepOneTMReal-Time PCR反應(yīng)體系中含 SYBR Premix ExTaq TM10μl（內(nèi)含 DNA聚合酶、Buffer、dNTP、SYBR Green）、上游引物 1μl、下游引物 1μl、目標(biāo) cDNA 模板 2μl、無 RNA 酶的蒸餾水 6μl，總體積為 20μl。反應(yīng)參數(shù):95℃變性 10min，95℃20s，59℃20s，40個(gè)循環(huán)，隨后從65℃至95℃每隔1℃記錄一次熒光值，獲得融解曲線。系統(tǒng)自動(dòng)測(cè)定的指標(biāo)有檢測(cè)樣品CT值、△CT值、△△CT值和融解曲線。使用β-actin作為內(nèi)參基因，將所測(cè)得的 Akt、mTOR、p70S6K和 eIF-4E基因的相對(duì)拷貝數(shù)除以內(nèi)參基因拷貝數(shù)，再取常用對(duì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:T=log2（目的基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)）[7]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示有顯著性差異。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 心臟重量及心系數(shù)

由表2可知，YC組小鼠心臟重量和心系數(shù)顯著高于AC組（P<0.05）。E組小鼠心臟重量和心系數(shù)較AC組顯著增大（P<0.05），但體重沒有明顯差異。E組小鼠心臟重量和心系數(shù)低于YC組，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 小鼠心臟重量與心系數(shù)的變化（n=12）Table 2 Change in heart weight and heart weight/body weight in mice

2.2 心肌組織HE染色

HE染色（圖1）顯示:YC組心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，著色均勻，細(xì)胞核呈卵圓形，核大小均勻，位于心肌纖維的中央（圖1A）。AC組小鼠心肌橫截面空白區(qū)域較YC組增大，但心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核染色清晰，未見細(xì)胞核溶解、局限性間質(zhì)水腫等病理性改變（圖1B）。E組小鼠心肌橫截面空白區(qū)域較YC及AC組增大，但心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核染色清晰，未見變性及壞死現(xiàn)象（圖1C）。

2.3 Akt/mTOR通路基因表達(dá)

表3顯示，AC組小鼠心肌 Akt、mTOR、p70S6K和eIF-4E mRNA表達(dá)水平與YC組相比顯著下降（P<0.05）；耐力訓(xùn)練后E組小鼠心肌Akt、mTOR、p70S6K和eIF-4E mRNA表達(dá)水平與AC組相比顯著增強(qiáng)（P<0.05）；耐力訓(xùn)練后E組小鼠心肌Akt、mTOR、p70S6K和 eIF-4E mRNA表達(dá)水平與YC組相比，表達(dá)有所下降，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表3 各組小鼠心肌Akt、mTOR、p70S6K和eIF-4E mRNA表達(dá)比較（n=8）Table 3 The mRNA expression of cardiac Akt，mTOR，p70S6K and eIF-4E of each group

3 討論

3.1 耐力訓(xùn)練與運(yùn)動(dòng)性心肌肥大

心系數(shù)是反映心肌肥大的重要指標(biāo)。一般認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)性心肌肥大是心臟對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的適應(yīng)性反應(yīng)，是一種生理性心臟重塑的過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，耐力訓(xùn)練后衰老小鼠心臟重量及心系數(shù)增加，與AC組相比具有顯著性差異，且小鼠心肌細(xì)胞及結(jié)締組織未出現(xiàn)病理性改變，表明耐力訓(xùn)練誘導(dǎo)了衰老小鼠運(yùn)動(dòng)性心肌肥大的形成。器官體積的增大原因包括:細(xì)胞數(shù)目的增多和細(xì)胞體積的增大，而成熟的心肌細(xì)胞基本喪失分化、繁殖的能力，因此E組小鼠心臟發(fā)生肥大的主要原因是由于心肌細(xì)胞體積的增大，提示心肌細(xì)胞蛋白合成增加。

3.2 Akt/mTOR信號(hào)通路與心肌細(xì)胞肥大

研究表明，Akt/mTOR信號(hào)通路激活蛋白質(zhì)翻譯，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，是細(xì)胞生長(zhǎng)的中心調(diào)控者，在決定細(xì)胞、組織及器官大小中發(fā)揮重要作用[8]。激活的Akt主要通過促進(jìn)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）來發(fā)揮促細(xì)胞生長(zhǎng)生存功能。mTOR的激活是心肌細(xì)胞蛋白合成的直接因素，其主要下游作用靶物質(zhì)包括核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）和真核翻譯起始因子eIF-4E結(jié)合蛋白[9]。p70S6K活化后能夠磷酸化激活S6蛋白，提高核糖體蛋白、延伸因子、polyA結(jié)合蛋白等的翻譯效率，進(jìn)而調(diào)控 5’TOP（5’terminal oligopyrimidine tract）mRNA翻譯蛋白的起始，有利于蛋白質(zhì)合成[10]。eIF4E的水平和活性決定了核糖體與mRNA結(jié)合的速度，在帽依賴性翻譯的調(diào)節(jié)中起中心作用，是蛋白合成過程的一種限速蛋白。mTOR通過調(diào)控eIF4E和p70S6K這兩條不同的下游通路，分別控制特定亞組mRNA的翻譯。在本實(shí)驗(yàn)中，AC組小鼠心臟重量和心系數(shù)低于YC組的結(jié)果表明，衰老小鼠的心臟重量下降。結(jié)合形態(tài)學(xué)的檢測(cè)，我們認(rèn)為，其主要原因是心肌細(xì)胞凋亡引起的心肌細(xì)胞流失和蛋白合成效率降低，使心肌纖維質(zhì)量下降。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)Akt/mTOR通路各靶基因的表達(dá)均明顯低于 YC組的結(jié)果，提示 Akt、mTOR、p70S6K和eIF-4E在心肌蛋白合成中具有重要作用，而整個(gè)Akt/mTOR信號(hào)通路各信號(hào)分子的表達(dá)隨衰老而降低，從而使衰老小鼠心肌細(xì)胞蛋白合成效率降低。

3.3 耐力訓(xùn)練對(duì)心肌Akt/mTOR信號(hào)通路的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，E組小鼠在耐力訓(xùn)練后，產(chǎn)生了運(yùn)動(dòng)性心肌肥大，且Akt/mTOR信號(hào)通路中各靶物質(zhì)的mRNA表達(dá)較AC組明顯增加，提示Akt/mTOR信號(hào)通路與運(yùn)動(dòng)性心肌肥大有關(guān)；E組小鼠心肌纖維的增粗提示心肌蛋白合成增加，而Akt和mTOR表達(dá)明顯增強(qiáng)，說明耐力訓(xùn)練可以提高Akt和mTOR的活性。有報(bào)道指出，mTOR不僅可以由Akt激活，運(yùn)動(dòng)更是獨(dú)立增加mTOR生成的主要因素[11]。由于本實(shí)驗(yàn)中未使用Akt的阻斷劑，故無法判斷mTOR mRNA表達(dá)的增高是否是由運(yùn)動(dòng)單獨(dú)引起的。使用雷帕霉素可以阻斷mTOR及其下游的p70S6K和 4E-BP1的活化，幾乎完全（95%）阻斷了肌肉肥大[12]，表明在肌肉適應(yīng)性肥大過程中需要mTOR及其下游p70S6K和eIF4E的作用。本實(shí)驗(yàn)E組小鼠心肌p70S6K和eIF4E mRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)，提示耐力訓(xùn)練可以通過激活mTOR的表達(dá)，增強(qiáng)心肌p70S6K和eIF4E的活性，證明p70S6K和eIF4E在心肌肥大過程中扮演了重要角色。目前對(duì)于Akt/mTOR信號(hào)通路研究更多的集中于骨骼肌，一般認(rèn)為耐力運(yùn)動(dòng)的刺激選擇性激活A(yù)MPK通路，從而抑制mTOR信號(hào)通路[13]。由于運(yùn)動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏或缺氧等因素引起AMPK含量升高，激活的AMPK能夠降低蛋白質(zhì)的合成而節(jié)約能量消耗，或通過AMPK磷酸化激活TSC2而間接抑制mTOR的活性[14]。我們的實(shí)驗(yàn)證明了耐力訓(xùn)練后心肌mTOR信號(hào)通路實(shí)際上是處于一種被激活的狀態(tài)，也從側(cè)面表明在心肌和骨骼肌中，耐力訓(xùn)練對(duì)Akt/mTOR蛋白合成信號(hào)通路的影響不同，心肌對(duì)于耐力訓(xùn)練所產(chǎn)生的蛋白適應(yīng)性合成增加主要通過mTOR信號(hào)通路。綜合整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為，耐力訓(xùn)練可以促進(jìn)衰老小鼠Akt和mTOR蛋白的活性，從而使p70S6K和eIF4E的表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)翻譯起始和增加蛋白合成，使心肌纖維肥大，產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性心肌肥大。

4 總結(jié)

耐力訓(xùn)練后，衰老小鼠心臟組織結(jié)構(gòu)正常，未見病理性改變；心臟絕對(duì)重量和心系數(shù)發(fā)生顯著性增加，表明小鼠發(fā)生了運(yùn)動(dòng)性心肌肥大；心臟Akt、mTOR、p70S6K和eIF-4E表達(dá)增加，表明耐力訓(xùn)練可激活心臟Akt/mTOR信號(hào)通路。耐力訓(xùn)練可以通過心臟對(duì)Akt/mTOR通路的作用，提高整個(gè)信號(hào)通路中各信號(hào)分子的表達(dá)，從而使衰老心臟發(fā)生生理性的運(yùn)動(dòng)性心肌肥大。

[1]Jing Lin，Elizabeth FL，Yufang Jin，et al.Age-related cardiac muscle sarcopenia:Combining experimental and mathematical modeling to identify mechanisms.Experimental Geron tology，2008，43（4）:296-306.

[2]Rodríguez-Calvo R，Serrano L，Barroso E，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor alpha down-regulation is associated with enhanced ceramide levels in age-associated cardiac hypertrophy.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2007，62（12）:1326-36.

[3]Kemi OJ，Ceci M，Wisloff U，et al.Activation or inactivation of cardiac Akt/mTOR signaling diverges physiological from pathological hypertrophy.Cell Physiol，2008，214（2）:316-21.

[4]Lee YI，Cho JY，Kim MH，et al.Effects of exercise training on pathological cardiac hypertrophy related gene expression and apoptosis.Eur J Appl Physiol，2006，97:216-224.

[5]Reznick AZ，Steinhagen-Thiessen E，Gellersen B，et al.The effect of short and long-term exercise on aldolase activity in muscles of CW-1 and C57/BL mice of various ages.Mech Ageing Dev，1983，23（3-4）:253-8.

[6]Fernando P，Bonen A，Hoffman-Goetz L.Predicting sub maximal oxygen consumption during treadmill running in mice.Can J Physiol Pharmacol，1993，71（10-11）:854-7.

[7]Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta CT）method.Methods，2001，25（4）:402-408.

[8]Lee CH，Inoki K，Guan KL.mTOR pathway as a target in tissue hypertrophy.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2007，47:443-67.

[9]Li W，Tan D，Zhang Z，et al.Activation of Akt-mTOR-p70S6K pathway in angiogenesis in hepatocellular carcinoma.Oncol Rep，2008，20（4）:713-9.

[10]Dreyer HC，Glynn EL，Lujan HL，et al.Chronic paraplegiainduced muscle atrophy down-regulates the mTOR/S6K1 signaling pathway.J Appl Physiol，2008，104（1）:27-33.

[11]Fluckey JD，Knox M，Smith L，et al.Insulin-facilitated increase of muscle protein synthesis after resistance exercise involves a MAP kinase pathway.Am J Physiol Endocrinol Metad，2006，290（6）:E1205-1211.

[12]Montagne J，Stewart MJ，Stocker H，et al.Drosophila S6 kinase:a regulator of cell size.Science，1999，285:2126-2129.

[13]Atherton，Babra，Smith K，et al.Selective activation of AMPKPGC21α or PKB/TSC/mTOR signaling can explain specific adaptive responses to endurance or resistance training-like electrical muscle stimulation.FASEB，2005，19（7）:786-788.

[14]Zarrinpashneh E，Beauloye C，Ginion A，et al.AMPKalpha2 counteracts the development of cardiac hypertrophy induced by is oproterenol.Biochem Biophys Res Commun，2008，376（4）:677-81.