蔬菜根結線蟲生防細菌的篩選

黃金玲，劉紀霜，劉志明，，陸秀紅，潘萍紅，陸光藝，秦碧霞，李國棟，

(1 廣西農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，廣西南寧 530007;2 南寧市試驗中心，廣西南寧 530001;3 廣西大學農(nóng)學院，廣西南寧 530005）

近年來根結線蟲Meloidogyne spp.在蔬菜上發(fā)生日趨嚴重，給蔬菜生產(chǎn)造成巨大損失.生產(chǎn)中主要以化學殺線劑來防治，但目前殺線劑品種少，且多為高毒、高殘留農(nóng)藥，不適合在蔬菜上使用.因此生物防治受到廣泛重視，根結線蟲生物防治天敵資源也在世界不同國家和地區(qū)被廣泛調(diào)查和篩選［1-6］.細菌由于易于培養(yǎng)、定殖，與植物根際具有較強的親和力，應用前景廣闊.本試驗在廣西開展了蔬菜根結線蟲生防細菌的篩選，以提供適合當?shù)氐纳谰?，為開展無公害防治蔬菜根結線蟲奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 根際細菌的采集與分離

在廣西蔬菜產(chǎn)地采集番茄Solanum lycopersicum、白菜 Brassica pekinensis、芹菜 Apium graveolens、豆角Vigna unguiculata spp.、紅薯 Ipomoea batatas、黃瓜Cucumis sativus、絲瓜 Luffa cylindrica、南瓜 Cucurbita moschata等作物的根際土壤樣品(包括無根結線蟲土、根結線蟲土及根結線蟲衰退土).采用稀釋分離法，于NA培養(yǎng)基平板上進行根際細菌的分離，所得分離物純化后保存、備用.

1.2 供試根結線蟲的繁殖與準備

供試根結線蟲為南方根結線蟲Meloidogyne incognita(Kofoid and White，1919)Chitwood，1949.采用活體繁殖方法，將番茄苗種到南方根結線蟲病圃中繁殖.從感病的番茄根部挑取南方根結線蟲新鮮卵塊，用φ為1%NaClO溶液表面消毒后，用滅菌水沖洗3次，置25℃恒溫箱中孵化.待孵化后收集幼蟲，并配制成約100條/mL的線蟲液，備用.

1.3 生防菌室內(nèi)篩選

細菌菌懸液對線蟲的作用測定:將分離到的菌株接種于NA固體培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)24 h后用無菌水配成109CFU/mL的菌懸液.分別吸取1 mL菌懸液和1.2中配好的線蟲懸浮液0.5 mL，加入到滅菌的培養(yǎng)皿中，置25℃下培養(yǎng)48 h，然后在體視顯微鏡下檢測線蟲的死亡率.以1 mL無菌水加0.5 mL線蟲懸浮液作為對照，每個菌株3個重復.

細菌發(fā)酵液對線蟲的作用測定:將細菌菌懸液室內(nèi)離體測定線蟲校正死亡率達到80%以上的菌株接種于NA液體培養(yǎng)基中，30℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，10000 r/min離心10 min，取上清液.同時將上清液原液稀釋成2倍液和5倍液，然后分別將上清液原液、上清稀釋液1 mL加入到滅菌的培養(yǎng)皿中，加入0.5 mL配好的線蟲懸浮液，一起放在25℃恒溫箱中培養(yǎng)，分別在24、36和48 h在體視顯微鏡下檢測并計算線蟲的死亡率，無菌水培養(yǎng)作為對照，3次重復.

2 結果與分析

2.1 細菌菌懸液對線蟲的作用

從蔬菜地無根結線蟲土、線蟲衰退土、根結線蟲土中采集和分離到359株細菌菌株，有336株菌株在一定程度上表現(xiàn)出殺死南方根結線蟲二齡幼蟲的能力(以蟲體僵硬，用針觸不動的線蟲視為已死亡的線蟲).用109CFU/mL的菌懸液處理幼蟲48 h，線蟲校正死亡率在90%以上有2株菌株，占0.55%;校正死亡率在80% ～90%有7株菌株，占1.95%(表1);校正死亡率在 70% ～80%的有 21株菌株，占5.85%;校正死亡率60% ～70%的有19株菌株，占5.29%.

表1 菌懸液處理48 h南方根結線蟲二齡幼蟲室內(nèi)校正死亡率達到80%以上的菌株Tab.1 Strains which the revised mortality of M.incognita J2 were over 80%in vitro condition after 48 h treatment

2.2 細菌發(fā)酵液對線蟲的作用

從表2可以看出，處理后 24、36和48 h后，各發(fā)酵上清液原液及其不同稀釋倍數(shù)液對南方根結線蟲二齡幼蟲均表現(xiàn)出一定的致死作用，且大部分是隨處理時間而逐漸增強，48 h后有8株菌株的發(fā)酵原液校正死亡率達到80%以上，其中17號、119號、155號、333號菌株的發(fā)酵液對南方根結線蟲二齡幼蟲的校正死亡率均比菌懸液處理高.發(fā)酵液經(jīng)過稀釋后，對幼蟲的致死作用減弱，稀釋5倍液對幼蟲的校正死亡率均低于50%，稀釋2倍液還表現(xiàn)出較好的作用，處理48 h有6個菌株對幼蟲的校正死亡率仍可達到50%以上.

表2 生防菌菌株發(fā)酵濾液及其不同稀釋倍數(shù)液對二齡幼蟲的校正死亡率1)Tab.2 The revised mortality of M.incognita J2 treated with ferment of strains in different concentrations %

3 結論

本試驗從無根結線蟲病土壤、根結線蟲衰退土和根結線蟲病土3種不同的土壤分離生防細菌，擴大了篩選范圍試驗.以對生產(chǎn)造成嚴重危害的南方根結線蟲二齡幼蟲作為供試線蟲，采用了收取卵塊人工孵化的方式獲取大量根結線蟲二齡幼蟲進行離體測定，來衡量生防菌毒力的高低，因在蟲齡、食性等方面差異小，可比性較強.

室內(nèi)離體拮抗測定結果表明:有336株菌株在一定程度上表現(xiàn)出對南方根結線蟲二齡幼蟲有致死作用，49株菌株對南方根結線蟲的室內(nèi)校正死亡率達60%以上;從線蟲衰退土中分離到64個菌株，經(jīng)室內(nèi)毒力測定，校正死亡率在80%以上的有3個菌株.說明廣西土壤富含大量對植物寄生線蟲有抗性的根際細菌，是一類重要的線蟲生防資源，而本地資源相對引進資源更易于定植，因此有待加強研究與開發(fā)利用.

研究結果還發(fā)現(xiàn)，有些菌株的發(fā)酵液對南方根結線蟲二齡幼蟲表現(xiàn)出較好的致死作用，效果甚至比菌懸液處理還好，但發(fā)酵上清原液經(jīng)過稀釋后對幼蟲致死作用均下降，這可能是由于有些細菌通過產(chǎn)生毒素代謝物或抗生素來毒殺線蟲，而稀釋后代謝物濃度降低使效果降低，其作用機制及代謝物的主要成分，還有待進一步的研究.

［1］汪來發(fā)，楊寶君，李傳道.華東地區(qū)根結線蟲天敵真菌調(diào)查［J］.菌物系統(tǒng)，2001，20(2):264-267.

［2］何勝洋，葛起新.南方根結線蟲天敵真菌［J］.植物病理學報，1987，17(1):14-21.

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［5］楊秀娟，何玉仙，陳福如，等.福建省根結線蟲卵囊真菌的分離與篩選［J］.福建農(nóng)業(yè)學報，2000，15(1):12-15.

［6］祝明亮，奚家勤.云南煙草根結線蟲拮抗真菌分離鑒定初報［J］.云南大學學報:自然科學版，2004，26(2):1741-78.