滲透劑的分子體積和極性表面積分率對胰凝乳蛋白酶抑制劑2熱穩(wěn)定性的影響

劉夫鋒 紀 絡 董曉燕

(天津大學化工學院生物化工系,天津 300072; 天津大學系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室,天津 300072)

滲透劑的分子體積和極性表面積分率對胰凝乳蛋白酶抑制劑2熱穩(wěn)定性的影響

劉夫鋒 紀 絡 董曉燕*

(天津大學化工學院生物化工系,天津 300072; 天津大學系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室,天津 300072)

滲透劑對蛋白質的穩(wěn)定能力不僅與其極性表面積分率(fpSA)有關,而且也與其分子體積(V)密切相關.因此對于滲透劑穩(wěn)定蛋白質能力的分析,需要同時考慮滲透劑的fpSA和V.為了考察滲透劑的fpSA和V對穩(wěn)定蛋白質能力的影響,本文以胰凝乳蛋白酶抑制劑2(CI2)為模型蛋白,首先利用分子動力學模擬,考察了數(shù)種典型滲透劑對CI2熱穩(wěn)定性的影響;并根據(jù)模擬數(shù)據(jù)計算得到了滲透劑影響蛋白質熱穩(wěn)定性的一維結構參數(shù);然后利用統(tǒng)計學雙參數(shù)擬合,同時引入滲透劑的fpSA和V,建立了用于分析滲透劑穩(wěn)定蛋白質能力的模型;最后利用模型分析了滲透劑的fpSA和V與其穩(wěn)定蛋白質能力的關系.研究發(fā)現(xiàn):利用分子動力學模擬結果定義并計算得到的一維結構參數(shù)能夠較好地描述在熱變性條件下滲透劑對CI2的穩(wěn)定能力;所建立的模型能夠很好地分析滲透劑對蛋白質的穩(wěn)定能力;并且由于V和fpSA二次項的引入,可大大提高僅以fpSA為參數(shù)的模型的精度;另外,滲透劑對蛋白質的熱穩(wěn)定能力與其V成正比;由于擬合公式中引入了fpSA二次項,在fpSA小于0.7時,fpSA與滲透劑的穩(wěn)定能力呈現(xiàn)負相關,但當fpSA大于0.7時,其與滲透劑的穩(wěn)定能力反而呈現(xiàn)正相關.

分子動力學模擬; 蛋白質穩(wěn)定性; 滲透劑; 極性表面積分率; 分子體積

蛋白質在一些極端條件(如極端的低溫和高溫、干燥以及高濃度的脲和鹽的環(huán)境)下會喪失原有的生物活性[1],但一些滲透劑能夠增強蛋白質在上述極端環(huán)境下的結構穩(wěn)定性,從而防止蛋白質失活[2-3].目前普遍認為滲透劑分子的優(yōu)先排阻作用是滲透劑穩(wěn)定蛋白質的主要原因[4-5].這是由于保護性滲透劑分子和水分子與蛋白質的親和力不同,使其相互作用優(yōu)先級不同.蛋白質優(yōu)先結合水分子,而排除滲透劑分子,從而使這些滲透劑分子在蛋白質表面發(fā)生排阻.因而相對溶液主體,蛋白質表面水分子增多而滲透劑分子減少.另外,滲透劑分子與蛋白質的相互作用使其化學勢升高,是熱力學不利的過程,其化學勢增加與蛋白質的溶劑暴露程度成正比.由于變性態(tài)蛋白質具有更大的溶劑暴露程度,同時滲透劑的加入又可使變性態(tài)蛋白質的化學勢升高程度更大,因此使變性態(tài)蛋白質變得更加不穩(wěn)定,從而使自然態(tài)蛋白質相對更加穩(wěn)定.即保護性滲透劑的優(yōu)先排阻作用使蛋白質變性態(tài)更加不穩(wěn)定,從而使平衡向折疊態(tài)移動來達到穩(wěn)定蛋白質自然結構的作用[6-7].

研究結果顯示,與蛋白質存在于純水溶液相比,蛋白質在保護性滲透劑溶液中會產生正的轉移自由能(ΔGtr),且實驗測得的ΔGtr值與其保護能力正相關[8-9].此外Bolen等[10]認為,由于滲透劑主要通過極性基團與蛋白質的主鏈發(fā)生作用,因此極性表面滲透劑分布越少就越容易被蛋白質所排阻,從而使其 ΔGtr值增加,穩(wěn)定能力更強,如氧化三甲胺(TMAO)和甜菜堿等.為了進一步辨析造成滲透劑穩(wěn)定能力差別的原因,他們又分別計算了常見滲透劑分子的極性和非極性基團表面積,并定義了極性表面積分率(fpSA),即:極性基團表面積占分子總表面積的比例.通過將不同滲透劑的fpSA與ΔGtr進行線性擬合,發(fā)現(xiàn)二者呈反比關系,且相關系數(shù)為0.81.

然而,很多實驗和模擬研究表明,如蔗糖和海藻糖等多羥基類滲透劑對蛋白質的穩(wěn)定具有很好的效果[11-14],可是它們的fpSA卻較大.作者進一步分析發(fā)現(xiàn)多羥基類滲透劑(甘油,山梨醇,海藻糖和蔗糖)穩(wěn)定蛋白質的能力與其fpSA呈正相關,這與Bolen的研究結果不一致.說明滲透劑穩(wěn)定蛋白質的能力與fpSA不是簡單的線性關系,可能存在復雜的函數(shù)關系.另外,我們[15]前期的研究表明,多羥基類滲透劑穩(wěn)定蛋白質的能力與其分子體積(V)呈正相關.因此我們認為fpSA只能代表滲透劑分子中極性和非極性表面積的相對比例,而V不僅決定了滲透劑分子的表面積,而且其對應的空間位阻效應與滲透劑優(yōu)先排阻作用也有直接關系.所以忽略滲透劑的V會造成滲透劑對蛋白質穩(wěn)定能力分析的誤差.

由于胰凝乳蛋白酶抑制劑2(CI2)具有結構典型、分子體積小等優(yōu)點,常用于實驗[16-17]和模擬研究[18-21].此外,研究表明CI2的熱變性中點溫度(Tm)高于353 K[22].眾所周知,模擬溫度越高,蛋白質熱變性速度越快,從而可以大大減少計算時間.在363 K下進行模擬能夠使CI2在水溶液中盡快變性,這種方法在分子動力學模擬研究蛋白質變性的文獻中經常使用[18,23].同時,該模擬溫度低于水的沸點(373 K),從而使該模擬具有一定的生理意義.因此本研究以CI2為模型蛋白,首先運用分子動力學模擬(MD)[24]考察高溫(363 K)條件下,CI2在典型滲透劑(TMAO,甜菜堿,肌氨酸,脯氨酸,乙醇,甘油,山梨醇,海藻糖和蔗糖)溶液中的結構變化情況.由于通過MD所得的結構參數(shù)僅能反應蛋白質分子某一方面的結構變化,在此本研究借鑒了Daggett等[25]的方法,計算能夠反應CI2結構特性的一維參數(shù),并由此獲得基于模擬結果的滲透劑對蛋白構象的保護能力參數(shù)(PMD),將其作為模型的響應量;作為對比,將基于實驗結果的ΔGtr值也作為響應量;同時將fpSA和V作為自變量,運用統(tǒng)計學中的雙參數(shù)擬合建立準確的模型.利用所建模型分析上述滲透劑參數(shù)與穩(wěn)定蛋白質能力的關系,以期加深理解滲透劑穩(wěn)定蛋白質的機理,并為理性設計蛋白質復性助劑提供有益的指導.

1 計算方法

1.1 體系構建

CI2的初始結構從蛋白質數(shù)據(jù)庫(protein data bank,PDB)中獲得,PDB號為1YPC.TMAO,甜菜堿,肌氨酸,脯氨酸,乙醇,甘油,山梨醇,海藻糖和蔗糖的結構式如圖1所示.它們的拓撲結構通過PRODRG2服務器(http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/ cgi-bin/prodrg_beta)獲得[26].

首先將CI2放入一個立方體盒子(8 nm×8 nm×8 nm)中,然后將154個滲透劑分子隨機放入該盒子,并與蛋白質保持一定的距離.隨后將盒子中加滿水,并去除與蛋白質或滲透劑重疊的水分子.采用三次能量最小化模擬優(yōu)化該體系:首先,固定蛋白質和滲透劑分子的結構和位置不變,僅讓水分子的結構和位置發(fā)生變化;其次,僅固定蛋白質分子的結構和位置,使?jié)B透劑和水分子的結構和位置發(fā)生變化;最后,使所有的分子都可以自由運動.這三步優(yōu)化都通過1000個循環(huán)的最陡下降法和共軛梯度法來完成.

1.2 分子動力學模擬

將上述優(yōu)化好的體系進行分子動力學模擬,滲透劑的濃度選擇參考文獻中所用的0.5 mol·L-1[27-28],每個體系模擬時間為20 ns.各模擬體系的詳細信息如表1所示.從圖1可以看出,滲透劑分子的大小不同,在相同濃度下(一定的盒子體積中)相同數(shù)量的滲透劑所占體積不同,這樣就導致模擬盒子中水分子的數(shù)量不同.如,體積最小的乙醇體系中,共有16248個水分子,而體積最大的蔗糖體系中的水分子個數(shù)僅為14375(表1).模擬過程中,為了使模擬結果更具有代表性,對相同溫度下的同一體系通過改變動力學模擬參數(shù)中的隨機數(shù),使體系中各原子獲得不同的初始速度,得到了不同的模擬軌跡,這些模擬結果均具有相似性.

利用體系的勢能在模擬過程中保持穩(wěn)定來說明體系已經達到平衡,是很多文獻常用的方法[29-30].本文首先也觀察了體系的勢能變化曲線(圖2),從該圖可以看出,體系的勢能經過最初的急劇降低后趨于穩(wěn)定,所有模擬體系的勢能在最后5 ns的模擬過程中基本不變,說明體系已經達到平衡.隨后,又分析了表示蛋白質結構變化的參數(shù)——均方根偏差(RMSD)隨模擬時間的變化(圖3).四種多羥基類滲透劑的模擬數(shù)據(jù)可參見我們前期發(fā)表的文章[15].結果表明,蛋白質Cα的RMSD在最后5 ns內達到了平衡.因此,用最后5 ns的模擬數(shù)據(jù)進行分析具有代表性.此外,為保證數(shù)據(jù)可信,每個體系的模擬均重復了3-4次,并將這些結果取平均值進行考察.

表1 模擬體系的參數(shù)Table 1 Parameters of simulation systems

本文采用GROMACS 3.3.1分子動力學模擬軟件[31],水分子采用SPC模型,選擇GROMOS96力場[32]來表述分子之間的勢能.利用Lennard-Jones函數(shù)計算范德華作用力,非鍵截斷距離設為1.4 nm,非鍵作用原子列表每4個步長更新一次;用LINCS算法約束所有原子的鍵長,利用particle mesh Ewald方法[33]計算長程靜電相互作用,格點寬度設為0.12 nm;采用Verlet蛙跳算法[34]對每一步的運動方程進行求解,經過積分得到新時刻各原子的坐標,積分步長為2 fs,模擬過程中采用周期性邊界條件.所有模擬均在等溫等壓系綜下進行,溫度為363 K,通過Berendsen方法[35]控制溫度,時間常數(shù)設為0.1 ps.壓力為1.01×105Pa,壓力控制采用 Berendsen方法,壓力耦合常數(shù)為0.5 ps.所有分子動力學模擬計算均在曙光TC2600刀片服務器(每刀片包括4路4核的AMD Opteron 8347HE CPU和8 G內存)上完成(Dawning,Tianjin,China).

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

CI2的α-碳原子的均方根偏差、蛋白質分子內氫鍵、疏水溶液接觸面積、β折疊(β-sheet)、α螺旋(α-helix)、分子內天然接觸個數(shù)和側鏈接觸個數(shù)這七個參數(shù),都利用GROMACS軟件所自帶的程序計算獲得.滲透劑的分子體積利用大型藥物分子設計軟件SYBYL 6.92計算.模擬過程中采用VMD軟件[36]顯示和獲取CI2分子的典型構象.

參照Daggett等[25]的方法,按照式(1)計算任意時刻CI2分子的這些參量的平均偏差:

其中p為所選用的狀態(tài)參量,這里p的總數(shù)為7;i為模擬過程中任一時間點所代表的典型構象,s為參比狀態(tài)(這里為自然態(tài)N,此時i=1,即為初始時刻);xp,i代表CI2在i時刻的第p個狀態(tài)參量值.〈 Ri-N 〉代表i時刻CI2分子相對參比狀態(tài)的平均偏差程度,其值越大表示變性效果越強,例如自然狀態(tài)的〈 Ri-N 〉等于0.然后利用式(2)將〈 Ri-N 〉進一步轉化為衡量CI2結構性質的一維結構參數(shù)χ,即χ=1時表示此時刻蛋白質結構為天然折疊態(tài),而χ=0時則為完全變性態(tài):

其中中點值(midpoint)由CI2在純水溶液中的變性過程決定,即通過分析純水溶液中CI2的〈 Ri-N〉分布,當分布處于局部最小值并使得相應χ值為0.5時的〈 Ri-N 〉就確定為midpoint值.對最終5 ns的χ值取平均〈(χ〉).最后,利用式(3)定義滲透劑對其構象的保護能力(PMD)為該溶液的〈χ〉相比于純水溶液中的〈χ〉w的相對偏差,

作為對比,本文首先僅將fpSA作為自變量(x),分別以PMD和ΔGtr作為響應量(y)進行線性擬合,其擬合公式如式(4)所示:

然后將fpSA和V同時作為自變量(x),分別以PMD和ΔGtr作為響應量(y),進行雙參數(shù)擬合,同時考慮交叉項和二次項的擬合公式如式(5)所示:

β0為常數(shù)項,而k=2.擬合過程中只將線性項和顯著程度大于0.9(即該項不能解釋的數(shù)據(jù)少于總量的10%)的二次項保留在最終的擬合公式中.

2 結果和討論

2.1 不同滲透劑對CI2二級結構的影響

模擬初始時刻,各溶液體系中的CI2蛋白均處于自然狀態(tài),如圖4A所示;經過20 ns的模擬,在不同滲透劑溶液中的模擬最終時刻CI2的分子構象分別如圖4(B-F)所示.可以看出,在純水溶液中,CI2的結構基本被破壞,表現(xiàn)為其α螺旋和β折疊區(qū)域基本上被轉角和無規(guī)則卷曲的二級結構所取代(圖4B).而在滲透劑溶液中,CI2的自然結構得到了不同程度的穩(wěn)定.例如在肌氨酸和脯氨酸溶液中,模擬結束時CI2自然結構中的β折疊區(qū)域得到了很好的維持(圖4C和4D);而在含有TMAO和甜菜堿的溶液中,CI2構象中的β折疊和α螺旋都得到了較好的保護(圖4E和4F).同樣如海藻糖,蔗糖等多羥基類滲透劑也具有不同的保護能力,但其他化合物如乙醇對蛋白質熱穩(wěn)定性基本沒有抑制能力,這些模擬數(shù)據(jù)可參見我們前期發(fā)表的文章[15].

2.2 CI2的一維結構參數(shù)在不同溶液中的變化

由于圖4只能顯示模擬最終時刻的蛋白構象.雖然蛋白質結構的其他性質能夠由均方根偏差(圖3)、疏水溶液接觸面積等結構參數(shù)表示出來,但如何用單一參數(shù)定量化精確化地表示某一時刻CI2的結構特點,進而定義不同滲透劑穩(wěn)定蛋白質能力的差別,是非常重要的.

本研究中,作者首先利用分子動力學模擬所得數(shù)據(jù),根據(jù)式(1)和(2)計算得到各溶液中CI2的一維參數(shù)χ的變化情況,并將其作為衡量CI2分子結構性質的反應坐標,以模擬時間為橫坐標,做出CI2分別在純水溶液和4種滲透劑溶液中的χ值隨模擬時間的變化趨勢(圖5).從該圖可以看出,純水溶液中CI2的χ值在模擬初期急劇下降,在最后2 ns內基本穩(wěn)定在0.2左右;而在滲透劑溶液中,雖然初始階段χ值也存在一定程度的下降,但是平衡階段的χ值卻比純水溶液中的高,這表明了滲透劑對CI2分子結構都有穩(wěn)定效果.通過比較,可以發(fā)現(xiàn)TMAO和甜菜堿對CI2的穩(wěn)定效果最好,其χ值保持在0.8左右;而肌氨酸和脯氨酸溶液的穩(wěn)定效果就稍差一些,其χ值約在0.6到0.7之間,這與圖4的結論是一致的.同樣CI2在海藻糖、蔗糖等多羥基類滲透劑溶液中的χ值與它們各自的保護能力也呈很好的相關性,這些模擬數(shù)據(jù)可參見我們前期發(fā)表的文章[15].由于這里χ的變化趨勢基本體現(xiàn)了純水溶液中的變性趨勢,以及滲透劑溶液中的穩(wěn)定效果,并且與之前文獻有著相似的結果[25],因此認為這一定義和計算是可信的,可以用其計算其他相應的參數(shù).為了更精確地表示不同滲透劑對CI2熱變性的保護能力和下一步數(shù)學建模的需要,我們根據(jù)式(3)進一步定義了滲透劑對CI2結構的保護能力參數(shù)(PMD).

2.3 對滲透劑穩(wěn)定能力的雙參數(shù)擬合

表2列出了各滲透劑分子的性質:如fpSA、V以及各種滲透劑對CI2的保護能力參數(shù)(PMD和ΔGtr).其中fpSA、V及PMD值為計算結果,而ΔGtr為文獻中的實驗值[10].可以看出,甲胺類物質的fpSA普遍較小,而多元醇類的fpSA則較大,這是由于它們含有多個羥基所造成的,這與文獻[10]中報道的一致;同樣V作為體積的量度也能較好地反映滲透劑分子體積的相對大小趨勢,例如含有兩個六元環(huán)的蔗糖和海藻糖的V最大,而TMAO、肌氨酸的V最小(如圖1所示).基于分別從模擬和實驗角度來衡量滲透劑穩(wěn)定能力的考慮,在此將PMD和ΔGtr進行線性擬合,如圖6所示.二者的相關系數(shù)為0.81,說明通過分子動力學模擬得到的滲透劑對蛋白質的穩(wěn)定能力的趨勢與實驗測量的結果是一致的,這也從另一個方面證明了模擬結果的可信度.

表2 滲透劑的性質Table 2 Properties of osmolytes

為了分析fpSA與滲透劑穩(wěn)定能力之間的關系,首先只將fpSA與基于MD模擬結果計算所得到的PMD按照式(4)擬合,得到預測公式(線性相關系數(shù)R2=0.10):

然后將fpSA和V同時作為自變量,與PMD按照式(5)進行雙參數(shù)擬合,得到預測公式(R2=0.94)為:

如利用PMD值與Pcal值之間的R2表示該模型的擬合精度,可以看出,單獨采用fpSA作為自變量擬合,其線性相關系數(shù)僅為0.10.這說明至少在本研究范圍內,單獨用滲透劑分子的fpSA并不能很好地衡量它們對蛋白質的熱穩(wěn)定能力.相反,若將滲透劑分子體積V和fpSA二次項同時引入,即可使線性相關系數(shù)從0.10提高到0.94.這不僅說明滲透劑的分子體積與蛋白質的熱穩(wěn)定能力密切相關,也證明作者之前的分析,即若同時考慮滲透劑分子體積和fpSA二次項可大大提高模型的精度和預測的準確度.

為了進一步驗證上述結論,在此用實驗測得的數(shù)據(jù)(ΔGtr)[10]代替PMD作為響應量,同樣分別進行了單參數(shù)和雙參數(shù)的擬合.

單參數(shù)fpSA的預測公式(R2=0.36)為:

結果表明,利用雙參數(shù)擬合也可使R2從0.36提高到0.98,這進一步驗證了滲透劑分子體積V和fpSA二次項的引入提高了模型的精度.

2.4 模型自變量對滲透劑穩(wěn)定能力影響的分析

為了進一步分析模型自變量(V,fpSA)對滲透劑穩(wěn)定能力的影響,將一個自變量固定在其平均值附近,計算得到PMD隨另一個自變量的變化趨勢(圖7).在圖7A中,當fpSA的值較小時(fpSA＜0.7),PMD會隨著fpSA的上升而下降,這與Bolen等[10]的研究結果一致,即滲透劑的穩(wěn)定能力與其fpSA負相關.但是,受公式中fpSA二次項的影響,當 fpSA值大于 0.7時,fpSA的增加反而會使?jié)B透劑的穩(wěn)定能力逐漸增高,即此時滲透劑的穩(wěn)定能力與fpSA呈正相關.此結果即可用于解釋多羥基類滲透劑對蛋白質的穩(wěn)定能力會隨著fpSA的增加而上升的原因.同時也說明fpSA二次項的引入是使模型精度提高的原因之一.

圖7B所示為滲透劑的保護能力(PMD)隨其體積(V)的變化情況.結果表明,PMD始終隨著V的增大而增大.分析原因認為,分子體積代表了滲透劑分子在蛋白質表面空間位阻效應的大小,較大的體積有助于它們被蛋白質優(yōu)先排阻,而許多研究證明滲透劑的優(yōu)先排阻作用是其穩(wěn)定蛋白質的主要作用力.因此滲透劑的穩(wěn)定能力與其分子體積呈正相關[37-38].

3 結 論

利用分子動力學模擬和統(tǒng)計學分析方法,考察了不同滲透劑對CI2熱穩(wěn)定性的影響,并且將滲透劑的極性表面積分率(fpSA)和分子體積(V)同時作為自變量,并引入fpSA二次項,分別以模擬得到的熱穩(wěn)定能力(PMD)和實驗測得的轉移自由能(ΔGtr)值為響應量,進行雙參數(shù)擬合.結果顯示:滲透劑會不同程度地提高CI2對熱的穩(wěn)定性;本研究根據(jù)分子動力學模擬結果定義并計算得到的一維結構參數(shù)能夠較好地描述在熱變性條件下滲透劑對CI2的穩(wěn)定能力;滲透劑對蛋白質的熱穩(wěn)定能力與其V成正比,并由于擬合公式中fpSA二次項的引入,fpSA與滲透劑的穩(wěn)定能力不再僅呈現(xiàn)負相關,當極性表面積分率大于0.7時,其與滲透劑的穩(wěn)定能力即可呈現(xiàn)正相關.并且滲透劑的V和fpSA二次項的引入可大大提高僅以fpSA為單參數(shù)的模型的精度,說明在分析滲透劑對蛋白質的穩(wěn)定能力時,同時考慮滲透劑V和fpSA即可大大提高模型預測的準確度.另外,當使用ΔGtr作為擬合模型的響應量時,也可得到相似的結論,這從另一個側面證明了模擬結果與實驗結果具有很好的相關性.

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Effects of Molecular Volume and Fractional Polar Surface Area of Osmolytes on the Thermal Stability of Chymotrypsin Inhibitor 2

LIU Fu-Feng JI Luo DONG Xiao-Yan*
(Department of Biochemical Engineering,School of Chemical Engineering and Technology,Tianjin University,Tianjin 300072, P.R.China; Key Laboratory of Systems Bioengineering,Ministry of Education,Tianjin University,Tianjin 300072,P.R.China)

We correlated the protective ability of osmolytes on proteins with their fractional polar surface area(fpSA) and molecular volume(V).Thus,both parameters need to be considered when the protective ability of osmolytes is analyzed.We carried out molecular dynamics simulations of the chymotrypsin inhibitor 2(CI2)in different osmolytes to probe the molecular basis of the stabilizing effect.Based on the simulation data,a one-dimensional structure parameter was first calculated.We then used a statistical bivariate fit model to obtain a theoretical model,which represents the stability capacity of the osmolytes.Finally,the model was used to analyze the correlation between the two parameters(fpSAand V)and the protective ability of the osmolytes.We found that the one-dimensional structure parameter characterized the protective ability of the osmolytes well.Using this model,the protective stability of the osmolytes can be analyzed accurately.The inclusion of V and the two-order term of fpSAgreatly increases the accuracy of the model.The protective capacity of the osmolytes increases with V.In addition,we introduced the two-order term of fpSAinto the fit formula.We found that the fpSAof the osmolytes is negatively correlated with its protective abilitywhen it is less than 0.7.However,when the fpSAof the osmolytes is larger than 0.7,it is positively correlated with its protective ability.

Molecular dynamics simulation; Protein stability; Osmolyte; Fractional polar surface area; Molecular volume

O641

Received:June 28,2010;Revised:July 19,2010;Published on Web:August 27,2010.

*Corresponding author.Email:d_xy@tju.edu.cn;Tel:+86-22-27406590.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20636040,20876111,20906068),National Key Basic Research

Program of China(973)(2009CB724705),Natural Science Foundation of Tianjin from Tianjin Municipal Science and Technology Commission,

China(08JCZDJC17100),and Independent Innovation Foundation of Tianjin University,China.

國家自然科學基金(20636040,20876111,20906068),國家重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃項目(973)(2009CB724705),天津市科委自然科學重點基金(08JCZDJC17100)和天津大學自主創(chuàng)新基金資助

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