響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲霉 X27液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸工藝條件

葉 硯 蔣冬花 嵇 豪

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,金華 321004)

響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲霉 X27液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸工藝條件

葉 硯 蔣冬花 嵇 豪

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,金華 321004)

基于 P-B法試驗(yàn)的結(jié)果,利用響應(yīng)面法對(duì)紅曲霉菌株X27液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸(GABA)的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。Plackett-Burman法確定了紅曲霉 X27液體發(fā)酵產(chǎn) GABA的三個(gè)主要的影響因素(溫度,pH和通氣量);然后利用響應(yīng)面分析方法,確定其最優(yōu)工藝條件為:34℃,pH 5.5,通氣量 120 L/h,其 GA2 BA產(chǎn)量可達(dá) 9.18 g/L。

紅曲霉 GABA Plackett-Bur man法 響應(yīng)面法 液態(tài)發(fā)酵

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid,GABA)是一種廣泛分布于細(xì)菌、真菌、藻類和動(dòng)植物中的非蛋白質(zhì)氨基酸[1]。研究表明:GABA具有抗焦慮、抗驚厥、降血壓、改善腦機(jī)能、促進(jìn)長(zhǎng)期記憶、增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、活化腎、肝功能等多種生理功能[2-4]。此外植物體內(nèi)的 GABA還參與抵御逆境脅迫反應(yīng)等作用以及調(diào)節(jié)花粉管生長(zhǎng)和植物生長(zhǎng)方向的功能[5-6]。

紅曲在我國(guó)有著 1 000余年的使用歷史,它是一種以大米為原料,經(jīng)紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的一種紫紅色的獨(dú)特米曲,廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和疾病治療,具有降血壓、降血脂等作用[7-8]。目前針對(duì)紅曲霉生物合成 GABA的研究大多采用固體發(fā)酵法。而深層發(fā)酵具有不易受雜菌污染,發(fā)酵中間過程調(diào)控方便的優(yōu)點(diǎn),更有利于 GABA產(chǎn)量的提高[9]。采用已有的一株產(chǎn) GABA的紅曲霉 X27,利用 Plackett-Burman(P -B)試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定影響其液體發(fā)酵產(chǎn) GABA的三個(gè)主要因素,并進(jìn)一步運(yùn)用響應(yīng)面法 (Response Surface Methodology,RS M)分析,確定了其產(chǎn) GABA的最優(yōu)生產(chǎn)條件[10]。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

紅色紅曲霉 (Monascus ruber)X27:浙江師范大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

KLF200發(fā)酵罐:瑞士比歐生物工程公司;M IK2 RO 22R高速冷凍離心機(jī):德國(guó) Hettich公司;Agilent 1200液相色譜儀:Agilent科技公司。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

試管斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基;

種子培養(yǎng)液:馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g,谷氨酸5 g,谷氨酸鈉 5 g,酵母浸膏 5 g,氯化鋅 1 g,硫酸鎂1 g,水 1 000 mL;

發(fā)酵培養(yǎng)液:葡萄糖 20 g,磷酸氫二鉀 1 g,磷酸二氫鉀 1 g,谷氨酸鈉 5 g,氯化鋅 1 g,硝酸鈉 5 g,硫酸鎂 1 g,硫酸亞鐵 0.01 g,水 1 000 mL。

培養(yǎng)方法:試管斜面接種后,在 30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7 d至菌絲長(zhǎng)滿斜面。用 5 mL無菌水洗下斜面孢子,接入裝有 50 mL種子培養(yǎng)液的 250 mL錐形瓶中,30℃、200 r/min搖床培養(yǎng) 72 h。將培養(yǎng)好的一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接入裝有 100 mL種子培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中[11],同樣條件下培養(yǎng) 48 h制成二級(jí)種子后,上罐發(fā)酵。

1.3 優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Minitab 15版進(jìn)行試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

1.3.1 Plackett-Bur man試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Minitab 15軟件的 P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)法,以溫度(X1),pH(X2),發(fā)酵罐罐壓 (X3),通氣量 (X4),接種量 (X5),攪拌槳轉(zhuǎn)速 (X6),種子級(jí)數(shù) (X7)作為試驗(yàn)因子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),GABA濃度 (Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行 7因子 2水平的 P-B設(shè)計(jì),各因子的編碼水平和取值如表1所示。

表1 P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因子編碼水平與取值表

根據(jù)表 1的編碼水平與取值,將數(shù)據(jù)輸入Minit2 ab 15運(yùn)行 P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

最陡爬坡試驗(yàn)以各顯著效應(yīng)值的大小來確定最陡上升路徑,而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小,正效應(yīng)的因素取較高值,負(fù)效應(yīng)的因素取較低值。根據(jù) P-B試驗(yàn)確定的影響 GABA發(fā)酵的主要因素,設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)。

1.3.3 RS M試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù) P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果進(jìn)行分析,將對(duì) GA2 BA發(fā)酵影響最大的三個(gè)因素確定為主要因素,進(jìn)行RS M試驗(yàn)設(shè)計(jì),采用Box-Behnken設(shè)計(jì)法進(jìn)行響應(yīng)面分析。根據(jù)所得結(jié)果建立回歸方程并描述各因子對(duì)響應(yīng)值的影響。

通過對(duì)回歸方程的方差分析,評(píng)價(jià)每個(gè)因子及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度,并用響應(yīng)面圖直觀地描繪結(jié)果,同時(shí)求出響應(yīng)值最大時(shí)各因子的水平。

1.4 分析方法

GABA含量采用 HPLC進(jìn)行檢測(cè)[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定影響紅曲 GABA產(chǎn)量的重要因子

表 2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果

表 3 P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

除以上 3個(gè)顯著因素外,其他因素的變化對(duì) GA2 BA的發(fā)酵產(chǎn)量影響不大,故后續(xù)試驗(yàn)采用同一條件:一級(jí)種子,罐壓 0.3 MPa,接種量 5%,攪拌槳轉(zhuǎn)速 200 r/min。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

針對(duì)溫度、pH、通氣量 3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn),其中溫度為正效應(yīng),pH和通氣量為負(fù)效應(yīng),將前者的值逐步增加,后兩者的值逐步減小以尋找最大響應(yīng)區(qū)域[13]。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表 4所示。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

由最陡爬坡試驗(yàn)可知:在溫度32.5℃,pH 5.5和通氣量125 L/h的條件下 GABA產(chǎn)量最高,設(shè)定溫度32.5℃,pH 5.5和通氣量 125 L/h為 RS M試驗(yàn)的中心點(diǎn),據(jù)此設(shè)計(jì)RS M試驗(yàn)。

2.3 RS M優(yōu)化發(fā)酵條件

2.3.1 回歸方程建立與方差分析

結(jié)合 2.1確定的影響 GABA產(chǎn)量的顯著因素及爬坡試驗(yàn)結(jié)果,重新定義溫度、pH、通氣量分別為X1,X2,X3并進(jìn)行 RS M試驗(yàn)。同時(shí)根據(jù)效應(yīng)值設(shè)計(jì)RS M試驗(yàn)高低水平,見表 5。

表5 RS M試驗(yàn)設(shè)計(jì)

運(yùn)用Minitab 15軟件設(shè)計(jì)出 RS M試驗(yàn) (表 6),以 GABA的產(chǎn)量為響應(yīng)值,將試驗(yàn)結(jié)果輸入Minitab 15進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,作出相應(yīng)的圖標(biāo)和數(shù)學(xué)模型,并根據(jù)圖表數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。從結(jié)果大體看出隨著溫度的升高 GABA合成量也在上升,pH的最佳范圍在5.5附近,通氣量的大小與 GABA產(chǎn)量呈反相關(guān)。

表 6 利用Minitab設(shè)計(jì)出的 RS M試驗(yàn)項(xiàng)目及結(jié)果

從表6可見,當(dāng)溫度為32.5℃,pH為5.5,通氣量125 L/h的情況下,G ABA的產(chǎn)量最高,為 9.18 g/L。

以 GABA產(chǎn)量為響應(yīng)值進(jìn)行分析后,Minitab 15給出的回歸系數(shù),建立回歸方程如下:

表7 回歸分析結(jié)果表

根據(jù)表 8的數(shù)據(jù)分析得出可知:失擬不足 (P= 0.213>0.05),而回歸方程的 P值小于 0.001,達(dá)到極顯著,數(shù)據(jù)分析的結(jié)果為:得 X1=34.29,X2= 5.50,X3=119.20,解值為 9.30。即當(dāng)溫度為34.3℃,pH為5.5,通氣量為 119.2 L/h時(shí),GABA的發(fā)酵值為9.30 g/L。

表8 方差分析表

2.3.2 響應(yīng)面以及等高線分析結(jié)果

響應(yīng)面圖是響應(yīng)面在各試驗(yàn)因子交互作用下得到的結(jié)果構(gòu)成的一個(gè)三維空間曲面。根據(jù)回歸方程,采用Minitab 15軟件回執(zhí)響應(yīng)面和等值線圖,考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀[14]。圖 1～圖 3是對(duì)響應(yīng)值G ABA影響最大的三個(gè)因素的交互作用的響應(yīng)面。

圖1 GABA關(guān)于溫度與pH的響應(yīng)面圖

由圖 1中可知,當(dāng)溫度在 (30.0,34.3)區(qū)間,pH在(5.0,5.5)區(qū)間內(nèi),GABA的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高,呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng)溫度在 (34.3,35.0)區(qū)間,pH在(5.5,6.0)區(qū)間內(nèi),GABA的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低,呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

圖2 GABA關(guān)于溫度與通氣量的響應(yīng)面圖

由圖 2可知,當(dāng)溫度在 (30.0,34.3)區(qū)間,通氣量在(100.0,119.2)區(qū)間內(nèi),GABA的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高,與兩者呈現(xiàn)正相關(guān)。當(dāng)溫度在(34.3,35.0)區(qū)間,通氣量在 (119.2,150.0)區(qū)間內(nèi), GABA的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低,呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

圖3 GABA關(guān)于pH與通氣量的響應(yīng)面圖

由圖 3可知,當(dāng) pH在(30.0,34.3)區(qū)間,通氣量在(100,119.2)區(qū)間內(nèi),GABA的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高,呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng) pH在 (34.3, 35.0)區(qū)間,通氣量在 (119.2,150.0)區(qū)間內(nèi),GABA單位產(chǎn)量隨著兩者的增高而降低,呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Minitab 15?？芍罴褩l件是:溫度為 34.3℃,pH為 5.5,通氣量在 119.2 L/h,此時(shí)紅曲菌 X27的 GABA產(chǎn)量最高,為 9.30 g/L。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證試驗(yàn)的可靠性,采用上述最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行 GABA發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn),考慮到實(shí)際操作的便利,將最佳條件修正為溫度 34℃,pH 5.5,通氣量為 120 L/h,經(jīng)測(cè)定,兩次平行試驗(yàn)的 GABA生產(chǎn)量分別為9.16 g/L和 9.21 g/L,GABA平均產(chǎn)量為 9.18 g/L,實(shí)測(cè)平均值與預(yù)測(cè)值無顯著差別,證明此次 RS M試驗(yàn)參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

Plackett-Burman法確定對(duì)紅曲菌液體發(fā)酵生產(chǎn) GABA影響重要的三個(gè)因素分別是溫度,pH和通氣量。響應(yīng)面法優(yōu)化后的工藝條件為,34℃,pH 5.5,通氣量 120 L/h。優(yōu)化后的 GABA產(chǎn)量達(dá)到9.18 g/L,比未優(yōu)化提高 74.7%。

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Opti mization of Fer mentation Conditions of Monascus X27 for Producingγ2Aminobutyric Acid

Ye Yan Jiang Donghua Ji Hao
(College of Chemistry and Life Sciences,ZhejiangNo rmalUniversity,Jinhua 321004)

Based on the results of a Plackett-Burman design experi ment,showing the most significant influen2 cing factors in biosynthesis ofγ2aminobutyic acid were temperature,pH and ventilation rate,the response surface methodologywas used to optimize the liquid fer mentation conditions for producingγ2aminobutyric acid byM onascus ruberX27.Results:The optimized fermentation conditions for theγ2aminobutyric acid production are 34℃,pH 5.5 and 120 L/h.Under the conditions,the yield ofγ2aminobutyric acid is 9.18 g/L.

monascus,γ2aminobutyric acid,Plackett-Bur man design,response surface methodology,liquid fer mentation

Q939.97 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1003-0174(2010)09-0106-05

浙江省重大科技專項(xiàng)(2007C12036),浙江省自然科學(xué)基金(Y3090343)

2009-10-10

葉硯,男,1984年出生,碩士,應(yīng)用微生物

蔣冬花,女,1964年出生,教授,微生物學(xué)與植物病理學(xué)