單波長比色法測定甘薯直鏈淀粉含量

黃立飛房伯平陳景益何秀英張雄堅(jiān)王章英羅忠霞

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所1,廣州 510640)

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所2,廣州 510640)

單波長比色法測定甘薯直鏈淀粉含量

黃立飛1房伯平1陳景益1何秀英2張雄堅(jiān)1王章英1羅忠霞1

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所1,廣州 510640)

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所2,廣州 510640)

對(duì)單波長比色法測定甘薯直鏈淀粉含量的條件進(jìn)行了優(yōu)化和分析,并對(duì)部分甘薯資源進(jìn)行了測定。結(jié)果表明:與馬鈴薯和玉米相比,甘薯直、支鏈淀粉 -碘復(fù)合物吸收曲線存在一定的差異;在 620 nm波長下,單波長比色法用于甘薯直鏈淀粉含量鑒定和評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性和精密度較高;測定的 35份甘薯資源直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變幅為 10.35%～20.72%,平均 16.67%。這些結(jié)論可為探索更加準(zhǔn)確、簡便、快捷地測定甘薯直鏈淀粉含量的方法和甘薯淀粉品質(zhì)改良提供參考。

甘薯 直鏈淀粉 比色法

甘薯是一種重要的淀粉作物,其淀粉廣泛用于食品、紡織、造紙、醫(yī)藥等工業(yè)。近年來,隨著消費(fèi)習(xí)慣的改變以及甘薯營養(yǎng)保健功能的認(rèn)識(shí),人們對(duì)甘薯淀粉和粉絲品質(zhì)越來越來關(guān)注。改良甘薯淀粉相關(guān)品質(zhì)已逐漸成為甘薯育種的主攻目標(biāo)[1],其中直鏈淀粉在甘薯淀粉品質(zhì)中具有十分重要的作用。例如,直鏈淀粉含量與甘薯粉絲的硬度負(fù)相關(guān),直鏈淀粉含量較低的甘薯品種食用表現(xiàn)為黏滑、食味總評(píng)好[2]。

目前,直鏈淀粉含量測定有多種方法,其中比色法簡單快速最為常用[2]。這種方法是基于淀粉與碘的顏色反應(yīng),因?yàn)橹挥兄辨湹矸叟c碘形成藍(lán)色,而支鏈淀粉與碘的結(jié)合能力很弱,而且顏色呈紫紅色。甘薯直鏈淀粉含量測定多借鑒水稻的國標(biāo)碘比色直鏈淀粉含量測定法[3],然而甘薯淀粉具有自身的特點(diǎn),與馬鈴薯、水稻、玉米淀粉相比,甘薯直、支淀粉-碘復(fù)合物的吸收峰存在明顯差異。

因此,本研究采用單波長比色法,并與甘薯直支鏈淀粉混合回歸方程、馬鈴薯直支鏈淀粉混合回歸方程及馬鈴薯直鏈淀粉與玉米支鏈淀粉混合回歸方程測定甘薯直鏈淀粉含量進(jìn)行了比較,同時(shí)對(duì)國家種質(zhì)廣州甘薯圃中的 35份甘薯種質(zhì)資源的直鏈淀粉含量進(jìn)行了測定。旨在為準(zhǔn)確測定甘薯直鏈淀粉含量尋找科學(xué)、簡便的方法,為甘薯食用品質(zhì)評(píng)價(jià)定量界定以及甘薯淀粉品質(zhì)改良提供參考。

1.1 試驗(yàn)材料

馬鈴薯標(biāo)準(zhǔn)直、支鏈淀粉:Sigma公司;玉米標(biāo)準(zhǔn)支鏈淀粉:Fluka公司。

甘薯直、支鏈淀粉:以“廣薯87”為原料,參照夏慧玲[4]和杜先鋒[5]的方法進(jìn)行分離純化獲得甘薯直鏈淀粉和支鏈淀粉,其中直鏈淀粉的純度為97.34%。

1.2 儀器設(shè)備

HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋:常州澳華儀器有限公司;DU 800型紫外/可見光分光光度計(jì):貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司;BS124S型分析天平:賽多利斯科學(xué)儀器 (北京)有限公司;FSJ-114型植物樣本粉碎機(jī):農(nóng)業(yè)部扶溝科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液配制以及直鏈與支鏈淀粉混合標(biāo)準(zhǔn)回歸方程的建立按 GB 7648-1987的方法進(jìn)行。

1.3.2 直鏈淀粉與支鏈淀粉碘復(fù)合物吸收光譜的全波長掃描

分別稱取 0.100 0 g直鏈淀粉或支鏈淀粉純品放入 100 mL的容量瓶中,加入 1 mL無水乙醇濕潤樣品,再加入 9 mL 1 mol/L NaOH溶液,于沸水浴中分散 10 min,迅速冷卻后用水定容;吸取 5 mL放入100 mL容量瓶中(同時(shí)另取一個(gè) 100 mL容量瓶,加入0.09 mol/L NaOH溶液5 mL作空白),然后依次加入約50 mL水,1 mL 1 mol/L乙酸及1 mL碘試劑,用去離子水定容至 100 mL(直鏈淀粉和直鏈淀粉的質(zhì)量濃度都為 50μg/mL),靜止 10 min后,進(jìn)行紫外可見光譜掃描。

1.3.3 測定樣品的處理

挑選中等大小的甘薯薯塊,洗凈切成片后四分法取樣,烘干后將樣品用粉碎機(jī)粉碎并通過 100目篩,混均勻裝入磨口瓶備用。甘薯干粉脫脂脫糖處理采用改良的王廣鵬[6]的方法進(jìn)行:

1.3.3.1 脫脂

準(zhǔn)確稱取 100 mg(干粉)樣品置于離心管中,加入石油醚 5 mL,渦旋 10 min,5000 r/min離心5 min,棄去上清液,重復(fù)脫脂 3次后烘干。

1.3.3.2 脫糖

準(zhǔn)確稱取 100 mg(干粉)樣品置于離心管中,加人 85%乙醇 5 mL,渦旋 10 min,5000 r/min離心5 min,棄去上清液,烘干。

1.3.3.3 脫脂脫糖

用石油醚脫脂 3次后再用 85%乙醇脫糖,棄去上清液,烘干。

1.3.3.4 吸光值測定

經(jīng)過脫脂或脫糖或脫脂脫糖處理的樣品加入1 mL無水乙醇充分潤濕樣品,再加入 9 mL 1 mol/L NaOH溶液,于沸水浴中分散 10 min,迅速冷卻后用蒸餾水定容至 100 mL。吸取分散液 5 mL于 100 mL容量瓶中,加水約 50 mL,再加入 1 mL 1 mol/L乙酸溶液和 1 mL碘液,用水定容后,靜置 10 min,測定吸光值。

1.4 添加回收率測定

為了檢查單波長比色法測定甘薯直鏈淀粉含量的準(zhǔn)確度,測定了樣品的添加回收率。計(jì)算公式為:

式中:c為添加回收率,M為加標(biāo)準(zhǔn)品后樣品測定的總質(zhì)量,m為樣品中原有直鏈淀粉的質(zhì)量,n為添加標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

直鏈淀粉含量按照 GB 7648-1987的計(jì)算方法計(jì)算,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用NPS分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯、馬鈴薯和玉米標(biāo)樣的碘復(fù)合物光譜差異

以 I2-KI溶液為空白對(duì)甘薯直、支鏈淀粉,馬鈴薯直、支鏈淀粉和玉米支鏈淀粉(質(zhì)量濃度分別為 50 μg/mL)進(jìn)行了 400～800 nm紫外可見光譜掃描(見圖 1、圖 2)。甘薯支鏈淀粉的最大吸收波長為 556 nm,其吸光值在三個(gè)支鏈淀粉中是最高的,馬鈴薯支鏈淀粉的最大吸收波長也為 556 nm,其吸光值居中,玉米支鏈淀粉的最大吸收波長為 534 nm,吸光值最低。由圖 2可知甘薯直鏈淀粉的最大吸收波長為642 nm,馬鈴薯直鏈淀粉的最大吸收波長為 632 nm,甘薯的直鏈淀粉吸光值高于馬鈴薯?？梢?通過馬鈴薯和玉米建立的回歸方程計(jì)算甘薯直鏈淀粉含量必然造成一定的系統(tǒng)誤差。

圖 1 支鏈淀粉 I2-KI吸收曲線(I2-KI為空白)

圖 2 直鏈淀粉 I2-KI吸收曲線(I2-KI為空白)

2.2 甘薯直鏈淀粉含量測定的最優(yōu)單波長選取

以 I2-KI溶液為空白,對(duì)單波長測定結(jié)果進(jìn)行了回歸分析。在甘薯直、支鏈淀粉混合回歸方程中(表 1),除了波長在 488 nm和 489 nm時(shí),相關(guān)系數(shù)較低外,其余波長測定的相關(guān)系數(shù)都為 0.999 9,相關(guān)顯著性均在 1%以上。另外在馬鈴薯的直、支鏈淀粉混合回歸方程中,回歸相關(guān)性有所下降,但其相關(guān)系數(shù)仍在 0.99以上,相關(guān)顯著性也在 1%水平以上。在馬鈴薯直鏈淀粉與玉米支鏈淀粉混合回歸方程中,除了波長為 435 nm和 436 nm時(shí),相關(guān)系數(shù)較低外,其余波長測定的相關(guān)系數(shù)都為 0.999 9,所以通過相關(guān)系數(shù)不能確定最佳測定波長。

表1 甘薯直鏈和支鏈標(biāo)準(zhǔn)曲線的單波測定

隨后選用 10個(gè)甘薯種質(zhì)資源測定 11個(gè)波長下的吸光值,每一波長下的 10份資源的平均吸光值差異分析見圖 3。波長為 620 nm時(shí),不同甘薯品種的吸光值差異極顯著,吸光值最大。所以結(jié)合建立的混合回歸方程和 10個(gè)甘薯品種吸光值差異,確定最優(yōu)測定波長為 620 nm。

圖3 11個(gè)波長下的平均吸光值比較

2.3 不同前處理對(duì)樣品測定結(jié)果的影響

將廣薯 42和廣紫薯 1號(hào)兩個(gè)品種進(jìn)行脫糖、脫糖脫脂、脫脂、不脫糖脫脂等 4種前處理(表 2),測定波長為 620 nm時(shí)的吸光值。兩個(gè)品種的統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致,即脫糖處理的吸光值與其他 3處理的差異極顯著,吸光值最大。而脫糖脫脂和脫脂的差異不顯著,未脫糖脫脂處理的吸光值最小,與其他 3個(gè)處理差異顯著。

表2 糖類和脂類對(duì)樣品測定結(jié)果的影響

2.4 樣品添加回收率測定試驗(yàn)

添加回收試驗(yàn)是驗(yàn)證測定方法準(zhǔn)確度的有效方法之一[7]。在已測得直鏈淀粉含量的品種“一點(diǎn)紅”的樣品中,添加準(zhǔn)確稱量的馬鈴薯直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品,在波長 620 nm下,按試驗(yàn) 1.2和 1.3的方法,測定了樣品添加回收率。每個(gè)處理 3個(gè)重復(fù),結(jié)果見表 3。利用馬鈴薯直鏈淀粉與玉米支鏈淀粉混合回歸方程(回歸方程 1)計(jì)算的回收率在 93.33%～103.43%之間,馬鈴薯直支鏈淀粉混合回歸方程 (回歸方程 2)計(jì)算的回收率在 89.72%～99.39%,計(jì)算符合檢測方法添加回收的要求范圍,說明利用本方法具有較高的準(zhǔn)確度。另外甘薯直支鏈淀粉混合回歸方程 (回歸方程 3)計(jì)算的回收率為 74.71%～82.77%,這與添加的是馬鈴薯直鏈淀粉而非甘薯直鏈淀粉導(dǎo)致的。另外平行測定值間差異不顯著(P<0.01),可見該方法的精密度較高。

表3 平均回收率測定結(jié)果

2.5 不同甘薯品種的直鏈淀粉含量

利用回歸方程 1、回歸方程 2和回歸方程 3測定35份甘薯資源直鏈淀粉含量,結(jié)果見表 4。以不同甘薯資源作為單因子,設(shè) 3個(gè)重復(fù),用NPS軟件進(jìn)行ANOVA分析,結(jié)果表明:廣薯 95-1與廣薯 07-115,廣紫薯 2號(hào)與廣薯 07-86,廣薯 70-9、廣薯 95 -145與廣薯 07-181,廣薯 07-214與心香,一點(diǎn)紅與廣薯03-128差異不顯著,其余的品種間直鏈淀粉含量存在極顯著的差異 (P<0.01)。差異不顯著的品種可能是由于只有單波長分析的結(jié)果。

由于回歸方程 3是由甘薯直、支鏈淀粉建立,用來計(jì)算更加能接近真實(shí)的甘薯直鏈淀粉含量。根據(jù)直鏈淀粉含量(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示)將 35份資源區(qū)分為以下類群:質(zhì)量分?jǐn)?shù) >20.0%為高含量品種,包含3個(gè)品種;質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于 15.0%～20.0%為中等含量品種,包含 27個(gè)品種;質(zhì)量分?jǐn)?shù) <15.0%低含量品種,包含 6個(gè)品種。在這些品種中廣薯 07-94、廣薯95-1和廣薯 07-115等品種的直鏈淀粉含量較高,明顯高于其他品種。而廣薯 95和廣薯 92-66等品種的直鏈淀粉含量要明顯低于其他品種。其中廣薯95的直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為 10.35%,廣薯 07-94的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為 20.72%,廣薯 95的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比廣薯 07-94低 10.37%。35個(gè)甘薯種質(zhì)資源的平均直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 16.67%。

表5 甘薯直鏈淀粉平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

3 討論與結(jié)論

3.1 甘薯直鏈淀粉含量測定方法分析

甘薯支鏈淀粉的最大吸收波長與馬鈴薯支鏈淀粉的最大吸收波長一樣,而吸光值不一樣 (圖 1),這可能是由于甘薯支鏈淀粉分枝程度較低等原因造成。另外檢驗(yàn)糖脂類對(duì)甘薯直鏈淀粉含量測定的干擾程度,發(fā)現(xiàn)脫糖后的吸光值最大,未脫脂脫糖的吸光值最小,脫脂脫糖和脫脂的吸光值差異不顯著,這與文獻(xiàn)報(bào)道的板栗結(jié)果不一致[6]。這些結(jié)果都有待于進(jìn)一步研究。另外 pH值和溫度對(duì)測定結(jié)果也影響較大,為了保證測定結(jié)果,本研究測定均在 pH 3.5以及 25℃室溫的條件下進(jìn)行。

甘薯直、支鏈淀粉具有自身的特點(diǎn),所以根據(jù)馬鈴薯直、支鏈淀粉和玉米支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)樣品來測定甘薯直鏈淀粉含量,必然產(chǎn)生一定的系統(tǒng)誤差,在本研究中也得到了證實(shí)。因此在沒有甘薯直、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品的情況下,利用馬鈴薯直、支鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線來估算甘薯的直鏈淀粉含量時(shí),必須考慮系統(tǒng)誤差的影響。

戴雙[8]和查菲娜[9]通過單波長、雙波長和多波長比色法進(jìn)行了小麥直、支鏈淀粉含量的比較研究,發(fā)現(xiàn)雙波長和多波長法可以有效地排除其他物質(zhì)的干擾,測定結(jié)果優(yōu)于單波長法。本研究通過建立了直、支鏈淀粉的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線消除支鏈淀粉與碘形成的紫紅色復(fù)合物的吸收背景。但是該方法測定的準(zhǔn)確性依賴于直、支鏈淀粉含量和比例、鏈長組成及其分布。其中樣品與標(biāo)準(zhǔn)品直、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品混合比例不一致時(shí),就會(huì)產(chǎn)生測量誤差[10]。另外單波長法只能測定樣品中的直鏈淀粉含量,而不能測定支鏈淀粉含量。所以為了使測定的甘薯直鏈淀粉含量更接近甘薯真實(shí)直鏈淀粉含量,有必要分離高純度的甘薯直、支鏈淀粉后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時(shí)利用單波長、雙波長和多波長進(jìn)行比較分析。

3.2 不同甘薯品種(系)的直鏈淀粉含量分析

甘薯的直鏈淀粉含量的測定,不同的研究者得出的結(jié)果不一致。劉新裕等[11]報(bào)道甘薯全粉直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)變幅為 8.5%～17.32%,平均為14.25%。Yamakawa[12]發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)變幅為 12.1%～21.3%,平均為 17.0%。Braber等[13]對(duì) 106個(gè)品種研究發(fā)現(xiàn),直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 18.6%～27.1%,平均為 21.8%。本研究測定的 35個(gè)甘薯品種 (系)的平均直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)按照不同的計(jì)算方法分別為 20.83%、20.02%和 16.67%。這些測定結(jié)果的差異可能與所測定的基因型和測定方法的差異有關(guān)。

目前,大約 28%甘薯被加工成粉絲。其中直鏈淀粉含量對(duì)粉絲的品質(zhì)有明顯的影響,并可以通過直鏈淀粉的含量來選擇原料[14]。Collado等[15]也報(bào)道甘薯粉絲的硬度與直鏈淀粉含量呈負(fù)相關(guān)。本研究測定的 35份甘薯資源可以為甘薯粉絲加工提供參考。目前食用鮮薯的食味評(píng)價(jià),主要是通過鑒定人員品嘗得出結(jié)果,但是不同人食味喜好不同,不能客觀地作出評(píng)價(jià)。通過對(duì)直鏈淀粉含量與食味的相關(guān)性研究,使直鏈淀粉含量作為量化食味評(píng)價(jià)的其中一個(gè)指標(biāo)。另外利用本研究的直鏈淀粉含量測定方法對(duì)廣州國家甘薯資源圃的甘薯種質(zhì)資源進(jìn)一步鑒定篩選,挖掘出特異的高直、支鏈淀粉資源,擴(kuò)大甘薯種質(zhì)資源的利用。

總之,本研究對(duì)單波長比色法測定甘薯直鏈淀粉含量進(jìn)行了分析,并篩選出一些高直鏈淀粉甘薯資源和低直鏈淀粉甘薯資源。本研究結(jié)果為直鏈淀粉含量測定方法的探索、量化甘薯食味評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、淀粉品質(zhì)改良中的親本選擇提供了基礎(chǔ)。

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Determination ofAmylose Content in Sweet Potato by SingleWavelength Colorimetry

Huang Lifei1Fang Boping1Chen Jingyi1He Xiuying2Zhang Xiongjian1Wang Zhangying1Luo Zhongxia1

(Crop Research Institute,GuangdongAcademy ofAgricultural Sciences1,Guangzhou 510640) (Rice Research Institute,GuangdongAcademy ofAgricultural Sciences2,Guangzhou 510640)

The single wavelength colori metrymethodwas tested to deter mine the amylose content in sweetpotato (Ipom oea batatas(L.)Lam),and some varietieswere evaluated.Results:The absorbance spectrums of amylose and amylopectin complexeswith iodine are quite different for s weet potato,which is not the same case as for potato starch or corn starch.In 620 nm,the single-wavelength colorimetry method possesses characteristics of well stability and high accuracy for s weet potato and is suitable for identification and evaluation of s weet potato.The identified amylose contents of 35 sweetpotato varieties range from 10.35%to 20.72%,with an average of 13.66%.The resultsprovide a reference for developing a rapid,accurate and convenient method of deter mining amylose content of s weet potato and improving the starch quality of sweet potato.

s weet potato,amylose,colorimetry

S531 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1003-0174(2010)05-0100-05

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金 (nycytx-16-B-5),農(nóng)業(yè)部保種項(xiàng)目 (NB08-2130135-14),國家公益性行業(yè)項(xiàng)目(nyhyzx07-012-04)

2009-06-18

黃立飛,男,1979年出生,研究實(shí)習(xí)員,薯類作物分子育種與品質(zhì)分析

房伯平,男,1961年出生,研究員,薯類作物品種資源與育種研究