超聲波輔助提取北五味子藤莖木脂素*

孟憲軍，薛雪，李斌，李元甦

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧省農(nóng)產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽，110161)

超聲波輔助提取北五味子藤莖木脂素*

孟憲軍，薛雪，李斌，李元甦

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧省農(nóng)產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽，110161)

木脂素是五味子的主要藥用成分，文中利用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波輔助提取北五味子藤莖總木脂素的工藝條件。采用比色法測(cè)定北五味子藤莖中總木脂素的含量，基于單因素實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用Box-behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化最佳提取方法，選取超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率作為自變量，以提取率作為響應(yīng)函數(shù)，采用響應(yīng)曲面分析法，確定提取北五味子總木脂素適宜工藝條件為:超聲波水浴溫度55℃，超聲功率208W，超聲波處理時(shí)間12.8 min，預(yù)測(cè)提取率可達(dá)到2.713%，與實(shí)測(cè)提取率(2.425±0.352)%較接近。

五味子，木脂素，超聲波提取

五味子［Schisandra chinensis(Turcz.)］Baill.為木蘭科植物，習(xí)稱“北五味子”［1］，廣泛分布于我國東北部山區(qū)，它的干燥成熟果實(shí)為臨床常用的滋補(bǔ)性中藥，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效［2］。木脂素是五味子的主要藥用成分［3－5］，具有抗腫瘤、抗病毒、保肝、抗衰老［6］等作用。研究表明，五味子藤莖可代替果實(shí)藥用，兩者具有相似的成分，尤其是木脂素類物質(zhì)成分基本相近［7］，含量約為果實(shí)的50%［8］。而且人工栽培和野生護(hù)養(yǎng)都需要將許多不結(jié)五味子果實(shí)的藤莖修剪下來，五味子藤莖資源很豐富，然而目前還沒有得到很好的利用。

本研究利用超聲波輔助法從北五味子藤莖中提取木脂素類物質(zhì)，因?yàn)槟局仡愇镔|(zhì)結(jié)構(gòu)多數(shù)含有一個(gè)亞甲二氧基，濃硫酸可使其水解并定量釋放出甲醇，后者可與變色酸反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色，所以可采用比色法以總木脂素含量為目標(biāo)成分，測(cè)定木脂素類物質(zhì)含量［9］。響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方法是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過實(shí)驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法［10］。應(yīng)用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，以提取率作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定超聲波輔助法提取北五味子藤莖中總木脂素的最佳工藝。

1 材料方法

1.1 材料與試劑

北五味子藤莖，自采于遼寧撫順新賓青松藥業(yè)有限公司的五味子GAP基地，干燥后粉碎，過60目孔篩，備用;五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)品，中國生物研究所(批號(hào):111529－200503);變色酸、濃 H2SO4、三氯甲烷等，均為分析純?cè)噭?/p>

粉碎機(jī)(遼寧省鳳城市農(nóng)機(jī)制造有限公司)，KQ－250DB型數(shù)控超聲波萃取器(昆山市超聲儀器有限公司)，WFJ－7200可見分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總木脂素含量的測(cè)定［11］

本實(shí)驗(yàn)采用比色法測(cè)定五味子中總木脂素含量。準(zhǔn)確稱取五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)品4 mg于10mL容量瓶中，用甲醇定容，取0.1mL甲醇作為空白樣，依次取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL 五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)溶液，揮去甲醇，再分別精密加入10%變色酸澄清水溶液0.5mL、濃 H2SO43mL、水 1.5mL，搖勻，置沸水浴中加熱30 min，迅速冷卻，以上述甲醇管為空白，分別在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算含量，以五味子酯甲含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品含量測(cè)定:吸取樣品液0.1mL，按照上述操作步驟測(cè)定吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算北五味子藤莖中總木脂素含量。

1.2.2 超聲波提取的工藝流程

稱取北五味子藤莖粉末→加乙醇配液→超聲提取→取上清液→硅膠攪拌→揮干、上柱、三氯甲烷洗脫，定容→測(cè)定吸光度值→計(jì)算提取率

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

以乙醇為提取液，選取超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率和乙醇濃度4個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按照1.2.1方法計(jì)算從北五味子中提取總木脂素的含量，并計(jì)算提取率，分別討論上述因素對(duì)提取率的影響。

圖1 五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.2.3.1 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

在5個(gè)50mL的三角瓶中分別裝入1.25 g北五味子藤莖粉末，按料液比(g∶mL)為1∶8加入體積分?jǐn)?shù)55%乙醇，在超聲功率為100 W，溫度為30℃，超聲時(shí)間分別為 5、10、15、20、25 min 下超聲溶解，自然冷卻后定容，準(zhǔn)確吸取55%乙醇溶液1mL加硅膠(100目)1g拌勻揮干乙醇，將硅膠裝入底部塞有少量棉花的玻璃層析柱(1.0cm×20cm)中，用三氯甲烷洗脫至10mL容量瓶中，定容。精密量取以上三氯甲烷洗脫液0.5mL于具塞試管中蒸干。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，測(cè)定各樣品吸光度值，根據(jù)讀數(shù)，計(jì)算提取率。

1.2.3.2 超聲溫度對(duì)提取率的影響

其他條件同1.2.3.1，超聲溫度分別為20、30、40、50、60℃下溶解10 min。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，計(jì)算提取率。

1.2.3.3 超聲功率對(duì)提取率的影響

其他條件同1.2.3.1，在超聲功率分別為50、100、150、200、250 W。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，計(jì)算提取率。

1.2.3.4 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

其他條件同1.2.3.1節(jié)，分別加入體積分?jǐn)?shù)為55%、65%、75%、85%、95%的乙醇。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，計(jì)算提取率。

1.2.4 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于第一階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用Design Expert軟件(Vision 7.0.0.1，stat-Ease.Inc.，Minneapolis，MN.USA)設(shè)計(jì)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化最佳提取方法，選取超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率作為自變量，以提取率作為響應(yīng)函數(shù)，采用響應(yīng)曲面分析法，通過回歸得出自變量與響應(yīng)函數(shù)之間的統(tǒng)計(jì)模型，確定提取北五味子總木脂素最佳工藝參數(shù)。

因此本實(shí)驗(yàn)以超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率為主要的考察因子(自變量)，分別以 X1、X2、X3表示，并以+1、0、－1分別表示自變量的高、中、低水平，按照方程xi=(Xi－X0)/△X對(duì)自變量進(jìn)行編碼，其中xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實(shí)值，△X為自變量的變化，本實(shí)驗(yàn)因子編碼及水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼表

北五味子總木脂素的提取率Y作為評(píng)價(jià)指標(biāo)(響應(yīng)值)的預(yù)測(cè)模型由最小二乘法擬合的二次多項(xiàng)式方程為:

方程(1)其中Y代表預(yù)測(cè)響應(yīng)值，β0為常數(shù)值，βi代表線性系數(shù)，βii代表二次項(xiàng)系數(shù)，βij代表交互項(xiàng)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素各因子對(duì)提取率的影響

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

由圖2可知，超聲時(shí)間在5～15 min時(shí)，隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，總木脂素含量由0.332%增加到0.696%，增加了0.364%。當(dāng)超聲時(shí)間超過15 min后提取率開始下降，當(dāng)超聲時(shí)間為25 min時(shí)，木脂素的提取率僅為0.194%，下降了0.503%，提取率下降的原因可能是超聲時(shí)間延長(zhǎng)，超聲波的作用強(qiáng)度增加，分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，所以選取超聲時(shí)間為15 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.1.2 超聲溫度對(duì)提取率的影響

由圖3可知，在50℃之前，隨溫度升高，木脂素的提取率不斷增加，從0.571%增加到1.073%，提高了0.503%;在60℃時(shí)，木脂素的提取率相比于50℃下降了0.05%，可能是因?yàn)闇囟冗^高，木脂素類物質(zhì)降解，所以選擇提取溫度為50℃。

圖3 超聲溫度對(duì)提取率的影響

2.1.3 超聲功率對(duì)提取率的影響

由圖4可知，超聲功率在50～150 W時(shí)，提取率增加幅度較大，由0.206%增加到0.935%。結(jié)果表明隨著超聲功率的增加，超聲波產(chǎn)生強(qiáng)烈振動(dòng)，加速度變大，強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用加速了有效成分進(jìn)入溶劑［12］。超聲功率在150～250W時(shí)提取率的增加量相對(duì)平緩，因此選擇超聲波功率為200 W為宜。

圖4 超聲功率對(duì)提取率的影響

2.1.4 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

由圖5可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在55%～75%時(shí)，提取率由0.068%增加到0.671%，將近擴(kuò)大了10倍;乙醇體積分?jǐn)?shù)在75%～95%時(shí)，提取率由0.671%增加到0.973%，提高了0.302%。表明木脂素的提取率隨乙醇濃度的增加而升高，并且在55%～75%增加幅度較大，考慮到乙醇濃度過高時(shí)，沸點(diǎn)下降，導(dǎo)致?lián)]發(fā)過大，一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加［13］，同時(shí)考慮到經(jīng)濟(jì)節(jié)約性，選擇體積分?jǐn)?shù)85%的乙醇比較合理。

2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 模型的建立與顯著性分析

圖5 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

根據(jù)RSM設(shè)計(jì)，選取17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，以超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率3個(gè)主要因素作為自變量，以提取率作為RSM響應(yīng)值。結(jié)果采用二次多項(xiàng)回歸擬和方法建立數(shù)學(xué)模型，獲得了預(yù)測(cè)相應(yīng)值(提取率，Response)與超聲溫度(X1，℃)、超聲時(shí)間(X2，min)和超聲功率(X3，W)的二次回歸方程如下:

對(duì)模型方程進(jìn)行方差分析表明，該方程顯著，通過校正決定系數(shù)(adjusted coefficient of deter minationg，)和相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient，R)來驗(yàn)證。此處R2=0.908 4，表明大約有90%的提取率變異分布在所研究的3個(gè)相關(guān)因素中，其總變異度僅有9.16%不能由該模型來解釋;相關(guān)系數(shù) R為0.979，表明提取率的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值間很好的擬合度;失擬項(xiàng)P=0.064 3＞0.07，表明方程的擬合不足檢驗(yàn)不顯著，二次響應(yīng)曲面回歸方程能夠很好的擬合本實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，所以該模型可以用于提取率實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。

2.2 超聲輔助提取北五味子總木脂素的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

RSM法的圖形是響應(yīng)值Y對(duì)應(yīng)自變量X1、X2、X3構(gòu)成的一個(gè)三維空間圖及在二維平面上的等高線圖，從實(shí)驗(yàn)所得響應(yīng)面分析圖上可以看出它們?cè)诜磻?yīng)過程中的相互作用，確定合適的工藝條件。圖6表明在超聲功率200 W條件下，超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖。圖7表明在超聲時(shí)間12.5 min，超聲溫度和超聲功率對(duì)提取率的響應(yīng)面圖。圖8表明在超聲溫度50℃的條件下，超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)提取率的響應(yīng)面圖。

2.3 模型驗(yàn)證及最佳提取條件的確定

對(duì)前面所獲得的第一個(gè)模型方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，X2X3項(xiàng)不顯著，舍去該項(xiàng)優(yōu)化模型，可以得到優(yōu)化后的回歸方程為:提取率/%=2.59+0.37 X1+0.19 X2+0.26 X3－0.30X1×X2－0.21X1×X3－0.30－0.36－0.47

去掉X2X3，項(xiàng)后方程中，表明調(diào)整后的模型與調(diào)整前的模型對(duì)提取率變異的描述準(zhǔn)確程度相當(dāng);而R2=0.949 3，表明調(diào)整后的模型和調(diào)整前的模型在實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值擬合度基本一致。利用優(yōu)化后的模型，通過對(duì)二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型的解逆矩陣，求出最大提取率的工藝條件:超聲溫度55.34℃，超聲時(shí)間12.82 min，超聲功率208.13W，預(yù)測(cè)北五味子總木脂素提取率達(dá)到2.713%。

圖6 超聲溫度和超聲時(shí)間交互影響提取率的響應(yīng)面圖

圖7 超聲溫度和超聲功率交互影響提取率的響應(yīng)面圖

圖8 超聲時(shí)間和超聲功率交互影響提取率的響應(yīng)面圖

為了驗(yàn)證回歸模型的有效性，根據(jù)推斷的最佳工藝參數(shù)和實(shí)際操作過程可行性進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在超聲溫度55.34℃，超聲時(shí)間12.8 min，超聲功率208 W條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)測(cè)提取率(2.425±0.352)%，與預(yù)測(cè)值較接近。結(jié)果表明預(yù)測(cè)值接近實(shí)際測(cè)量值，說明該模型是合理有效的具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

(1)由于超聲波在介質(zhì)中傳播，會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)或空化效應(yīng)，在一定程度上引起介質(zhì)的特性變化［14］。超聲波處理加大物料本身及介質(zhì)的傳質(zhì)作用，擊破原料的組織和細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)［15－16］，實(shí)驗(yàn)證明利用超聲波提取，總木脂素提取率明顯提高。

(2)利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇對(duì)總木脂素提取率有顯著影響的因素有:超聲波處理時(shí)間、超聲波功率和超聲波水浴溫度，做三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明上述三因素對(duì)總木脂素提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是超聲波處理時(shí)間、超聲波功率和超聲波水浴溫度的平方項(xiàng)對(duì)提取率有顯著影響。

(3)本研究利用Design Expert軟件對(duì)超聲波條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此方法具有良好的應(yīng)用性和預(yù)測(cè)性，能提供較準(zhǔn)確的變量和誤差信息。因此得到總木脂素提取率的最佳工藝條件為:超聲溫度55℃，超聲功率208W，超聲時(shí)間12.8 min，預(yù)測(cè)得率可達(dá)到2.713%，實(shí)測(cè)提取率為(2.425±0.352)%，從而為下一步工業(yè)化提取五味子藤莖中木脂素類物質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。

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Extraction of Total Lignans from Caculis of Schisandra chinensis(Turcz.)Baill with Ultrasonic Assistance

Meng Xian-jun，Xue Xue，Li Bin，Li Yuan-su
(College of Food，Shenyang Agriculture University，Provincia Key Laboratory of Further Processing of Food，Shenyang 110161，China)

Lignans are main medicinal ingredients in Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.Response surface methodlogy(RSA)is used for optimizing the ultrasonic extraction technology of total lignans from caculis of Schisandra chinensis(Turcz.)Baill with ultrasonic assistance.The experiment utilizes colorimetry method to determinate the total lignan content.Based on single experiments，ultrasonic treatment time，temperature，and power are selected as independent variables.We take the extraction as a response value，and make the response surface analyzer.According to Box－Behnken central composite design，a mathematical model is established.The optimum extraction conditions was:55℃，208w for an ultrasound treatment of 12.8 min .The predicted extraction yield is 2.713%，and the yield of total lignans is(2.425 ± 0.352)%，which agrees with the actual extraction(2.425 ± 0.352)%.

Schisandra chinensis(Turcz.)Baill，caculis，lignans，ultrasonic extraction

博士，教授(李斌博士為通訊作者)。

*“十一五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAI09B04)

2010－06－22，改回日期:2010－09－30