短乳桿菌NCL912耐酸性研究

黃桂東，李超波，曹郁生

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌，330047)2(河南科技大學(xué)食品科學(xué)和生物工程學(xué)院，河南洛陽，471003)

短乳桿菌NCL912耐酸性研究

黃桂東1，2，李超波1，曹郁生1

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌，330047)2(河南科技大學(xué)食品科學(xué)和生物工程學(xué)院，河南洛陽，471003)

研究了短乳桿菌NCL912在酸性環(huán)境下的生長及在pH2.0極端酸性環(huán)境中的耐酸性能。比較了在含L-谷氨酸鈉與不含L-谷氨酸鈉的培養(yǎng)基中該菌的生長、耐酸性、γ-氨基丁酸產(chǎn)量及谷氨酸脫羧酶活力，并對其耐酸機(jī)理進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，短乳桿菌NCL912在pH＞3.0的酸性環(huán)境中可以生長，在pH5.0的培養(yǎng)基中生長較好，在pH 2.0的培養(yǎng)基中可以存活4～6 h。含L-谷氨酸鈉培養(yǎng)基中細(xì)菌生長較好，在pH 4.0時，L-谷氨酸鈉全部轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸，產(chǎn)量達(dá)11.44g/L;在2種培養(yǎng)基中細(xì)菌的存活率存在顯著性差異(P＜0.05)，谷氨酸脫羧酶活力也存在顯著性差異(P＜0.05)，含L-谷氨酸鈉培養(yǎng)基中細(xì)菌耐酸性強(qiáng)，酶活力高。由此可見，短乳桿菌NCL912能夠耐受低pH的原因可能與γ-氨基丁酸的生成有關(guān)，即其耐酸機(jī)制可能是谷氨酸-γ-氨基丁酸對向運(yùn)輸機(jī)制。

短乳桿菌NCL912，L-谷氨酸鈉，γ-氨基丁酸，谷氨酸脫羧酶

乳酸菌具有多種生物活性，具有公認(rèn)的食品應(yīng)用安全性(generally regarded as safe，GRAS)，已經(jīng)成為食品工業(yè)中重要的微生物和益生菌來源。而應(yīng)用于食品或益生菌制劑中的乳酸菌一旦被宿主攝入體內(nèi)，就必須要耐受宿主胃的極端酸環(huán)境和腸道的弱酸環(huán)境(pH 4.0～6.0)。有研究表明，單胃動物胃液pH值一般在2.0左右，進(jìn)食后pH值可達(dá)3.0～5.0，饑餓狀態(tài)下的pH值是1.5，食物在胃中大約需要2 h才能被初步消化進(jìn)入腸道［1－2］。因而乳酸菌對酸性環(huán)境的耐受能力是其能否在胃腸道生長、生存并發(fā)揮有益作用的重要考察因素。另外，乳酸菌在糖發(fā)酵時產(chǎn)生乳酸，說明乳酸菌在生長過程中也要經(jīng)常面對酸性環(huán)境［3］。

本研究所使用的Lactobacillus brevis NCL912是從泡菜中分離得到的，培養(yǎng)基中若添加足量的底物L(fēng)-谷氨酸鈉(L-glutamate sodium，L-MSG)，那么該菌可以將L-MSG轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)，GABA產(chǎn)量高達(dá)80g/L以上。GABA是谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)生物催化L-谷氨酸的α-羧基脫羧反應(yīng)生成的，GAD是該反應(yīng)唯一的酶［4］。在大腸桿菌等原核微生物中，GAD酶途徑由于其可以調(diào)控環(huán)境的pH值而與細(xì)菌生長的耐酸機(jī)制有關(guān)［5－6］。盡管有研究表明，很多乳酸菌可以將谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA，但闡述GABA與乳酸菌酸耐受機(jī)制的相關(guān)報道較少，尤其是短乳桿菌，還未見耐酸機(jī)制的相關(guān)研究，目前，僅有的關(guān)于Lactococcus lactic的研究表明，GAD與酸耐受性直接相關(guān)［7］。

因此，研究短乳桿菌NCL912在酸性條件下的生長及其在極端酸性環(huán)境下的耐酸能力，對了解該菌的生理代謝特點(diǎn)，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

高產(chǎn)γ-氨基丁酸的短乳桿菌Lactobacillus brevis NCL912，本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基(1L)

葡萄糖25 g，大豆蛋白胨6.25 g，酵母浸膏6.25 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，MnSO4·4H2O 0.025 g，5mL Tween 80，L-谷氨酸鈉終濃度0.1mol/L。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基(1L)

葡萄糖50 g，大豆蛋白胨12.5 g，酵母浸膏12.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，10mL Tween 80。作為實(shí)驗(yàn)組用培養(yǎng)基。

1.2.3 對照培養(yǎng)基(1L)

葡萄糖50 g，大豆蛋白胨12.5 g，酵母浸膏12.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，10mL Tween 80，L-谷氨酸鈉終濃度0.1mol/L。作為對照組用培養(yǎng)基。

1.3 方法

1.3.1 菌體的培養(yǎng)

挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)液中，32℃靜置培養(yǎng)24 h，然后將其接種于裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，32℃，150 r/min搖床培養(yǎng)12h，活化2次。

1.3.2 pH值對菌體生長的影響

取活化2次后的菌液，5 000 r/min離心5 min，然后將離心后的菌體(4.1×109)接種于不同初始pH(自然 pH，5.0，4.0，3.5，3.0)的 100mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%，32℃靜置培養(yǎng)(后面的培養(yǎng)，若沒有特殊說明，接種量和培養(yǎng)溫度不變)，每隔2h取樣，測OD600nm，以時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制不同初始pH下菌的生長曲線，并測定培養(yǎng)基pH值、GABA的變化。培養(yǎng)基pH值用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)，pH值的偏差是±0.1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 L-MSG對菌生長的影響

按1.3.2的方法將菌株接種于對照培養(yǎng)基中，并取樣，繪制不同初始pH下菌體生長曲線，并測定培養(yǎng)基pH值、GABA的變化。比較發(fā)酵培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體的生長、pH值、GABA的變化。

1.3.4 測定方法

pH的測定:用酸度計測定。

GABA的定性及定量測定:采用薄層層析的方法對GABA進(jìn)行定性分析，預(yù)染紙層析的方法進(jìn)行GABA的定量測定［8］。具體定量方法如下，所使用的展開劑為 V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=5∶3∶2，展開劑中含有4g/L的茚三酮。在層析紙上的上樣量為2μL，然后將上樣之后的層析紙放置到裝有展開劑的層析缸中展開3 h，取出烘干，剪取GABA的點(diǎn)放置于洗脫劑中，洗脫劑為V(75%的乙醇)∶V(0.6%CuSO4)=38∶2，最后在紫外分光光度計上，512 nm處測定洗脫劑的吸光度值。

1.3.5 耐酸性實(shí)驗(yàn)

取活化2次后的穩(wěn)定期的菌液10mL(4.1×109)，8 000 r/min離心5 min，將菌體接種于pH 2.0的100mL發(fā)酵和對照培養(yǎng)基中，32℃靜置培養(yǎng)0～6 h，每隔2 h取樣。每次吸取0.5mL的菌液加入到4.5mL無菌水中，搖勻即制成了10倍稀釋液，依此再稀釋不同倍數(shù)。取稀釋樣品100μL于已制備好的含已滅菌瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，32℃靜置培養(yǎng)48 h，待菌落長出后，統(tǒng)計菌落數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.3.6 粗酶提取液的制備

取不同酸性pH培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液，8 000 r/min離心10min，收集的菌體用PBS(pH值7.0)充分洗滌2次，將其重懸于20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.2)中，內(nèi)含 0.01 mmol/L PLP，1 mmol/L β-巰基乙醇，0.2mg/mL溶菌酶，40℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后置于冰浴中，超聲波進(jìn)一步破碎。細(xì)胞碎片用冷凍離心(8 000 r/min，10 min)除去，得上清液，即為GAD粗酶液。

1.3.7 GAD酶的活性測定

取 200μL 的粗酶液，加 400μL 底物溶液(0.2mol/L Na2HPO4－檸檬酸緩沖液，含10 mmol/L L-MSG，pH 5.0)，37℃反應(yīng)1 h，90℃滅活5 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液，采用薄層層析和預(yù)染紙層析的方法［10］進(jìn)行GABA的定性和定量分析。在上述測定條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol的GABA所需的酶量定義為1個酶活力國際單位(U)。比較發(fā)酵組和對照組在不同酸性pH值條件下菌的GAD酶活力，觀察L-MSG對酶活力的影響。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，發(fā)酵組和對照組之間的差異性及各自組內(nèi)的差異性采用one way ANOVA方法進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌的生長曲線及培養(yǎng)液pH值的變化

由圖1可以看出，短乳桿菌NCL912的對數(shù)生長期是2～20 h。該菌NCL912在pH值＞3.0的酸性環(huán)境中可以生長且在初始pH值5.0的培養(yǎng)基中生長較好。

圖1 菌體的生長曲線

而培養(yǎng)液的pH值(圖2)在培養(yǎng)的初期(0～6h)有所升高，不同培養(yǎng)液pH值變化差值分別為0.38，0.77，0.20，0.30。隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液的 pH值有所下降，分別為1.75，1.24，0.81和0.44。

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)液pH的變化曲線

2.2 對照培養(yǎng)基培養(yǎng)菌的生長曲線和培養(yǎng)液pH值的變化

由圖3可以看出，在對照培養(yǎng)基中菌的生長與發(fā)酵培養(yǎng)基中菌的生長趨勢一致。在0～8 h，初始pH值5.0的菌體生長最好，8 h后初始pH值4.0的菌生長最好。這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基pH值發(fā)生了變化。隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液pH值升高(圖4)，8h后初始pH值4.0的培養(yǎng)液pH值升高至5.0左右。所以，認(rèn)為該菌在對照培養(yǎng)基中的最適pH值是5.0左右，和發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體最適pH值一致。另外，該菌在對照培養(yǎng)基中比在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長得好。對照培養(yǎng)基培養(yǎng)的穩(wěn)定期菌液的吸光度(pH值4.0，5.0)是發(fā)酵培養(yǎng)基菌液吸光度的1.61和1.33。而在自然pH值時，2種培養(yǎng)基中穩(wěn)定期菌液的吸光度之間的差別不是很大。

圖3 對照組菌體生長曲線

圖4 對照組培養(yǎng)液pH的變化

2.3 培養(yǎng)液中GABA的變化

由圖5中GABA量的變化可以看出，由于對照培養(yǎng)基中底物L(fēng)-MSG的加入，該菌可以將其轉(zhuǎn)化為GABA，所以培養(yǎng)液中GABA的產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時間的延長有所升高。初始pH5.0，4.0，3.5的菌株產(chǎn)GABA的量較高，其產(chǎn)量分別達(dá) 10.94，11.44和10.77g/L，L-MSG得到完全的利用。GABA是弱堿性物質(zhì)，所以GABA的產(chǎn)生使得對照培養(yǎng)液pH值上升，從而保護(hù)了菌體，能夠耐受低酸環(huán)境而生長及生存。

圖5 培養(yǎng)液中GABA的變化曲線

由圖5還可以看出，發(fā)酵組培養(yǎng)的菌株只在培養(yǎng)的初期會產(chǎn)生少量的GABA。這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中存在的少量L-谷氨酸或相應(yīng)的鹽被菌株所利用而產(chǎn)生的。在低pH時，發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株比對照培養(yǎng)基培養(yǎng)的生長差，原因之一就是與GABA的生成有關(guān)。因?yàn)镚ABA產(chǎn)生得少，所以pH值沒有發(fā)生明顯的升高。只在培養(yǎng)的初期有所升高，后來由于發(fā)酵過程中有機(jī)酸的生成，培養(yǎng)液pH值有所下降。

2.4 耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6的結(jié)果表明，在pH值2.0的極端酸性條件下(無論培養(yǎng)基中是否含有L-MSG)，該菌均有一定的酸耐受能力，能耐受極端酸性環(huán)境4～6 h。為該菌做為可應(yīng)用于食品工業(yè)的乳酸菌奠定了基礎(chǔ)。

對照組菌株的酸耐受能力比發(fā)酵組菌的酸耐受能力強(qiáng)。不同時間對照組和發(fā)酵組菌的存活率值之間有顯著性差異(表1)，但培養(yǎng)2h后的菌存活率之間沒有顯著性差異，說明在最初的培養(yǎng)階段二者都在適應(yīng)酸性的環(huán)境，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，對照組菌的存活率比發(fā)酵組菌的存活率高，呈顯著性關(guān)系。對照組菌在培養(yǎng)2h后菌的存活率顯著下降，培養(yǎng)2 h和培養(yǎng)4 h菌之間的存活率沒有顯著性差異，而發(fā)酵組菌隨著時間的延長，菌的存活率顯著下降。以上兩種結(jié)果的產(chǎn)生可能與L-MSG誘導(dǎo)生成GAD酶有關(guān)，使得菌酸耐受能力增強(qiáng)。

圖6 短乳桿菌NCL912的生存曲線

表1 酸應(yīng)激條件下菌的存活率

2.5 GAD酶的活性分析

表2的結(jié)果表明，初始pH 4.0的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌的GAD酶活力最高。對照組和發(fā)酵組的不同酸性pH培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌，其GAD酶活力有顯著性差異(P＜0.05)。

GAD是催化L-谷氨酸的α-羧基脫羧反應(yīng)生成GABA的唯一酶。GAD酶的活性在pH＜5.5的時候得到激發(fā)。同時培養(yǎng)基中的L-MSG可能會誘導(dǎo)產(chǎn)生GAD酶，這是在低pH下GAD酶活力較高的原因。

表2 GAD酶活性分析

3 討論

GABA是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［9］，具有多種的生理功能。GAD是生物催化L-谷氨酸的α-羧基脫羧反應(yīng)生成GABA的唯一酶。研究表明，當(dāng)培養(yǎng)基pH值降低時，一些細(xì)菌可以在一定范圍內(nèi)，依靠體內(nèi)穩(wěn)態(tài)機(jī)制保持pH值相對穩(wěn)定而存活。在原核微生物中，GAD與細(xì)菌生長的耐酸機(jī)制有關(guān)。主要是通過GAD和相關(guān)的Glu/GABA反向轉(zhuǎn)運(yùn)子協(xié)同發(fā)揮作用。乳酸菌細(xì)胞通過特異的轉(zhuǎn)運(yùn)體將外源谷氨酸或鹽轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，在GAD作用下脫羧，不可逆的消耗了細(xì)胞內(nèi)的H+。反應(yīng)產(chǎn)物GABA，通過反向轉(zhuǎn)運(yùn)體被排出胞外。最終結(jié)果是胞內(nèi)H+的消耗導(dǎo)致胞內(nèi)pH值升高，胞外的谷氨酸被轉(zhuǎn)變成堿性略強(qiáng)的GABA，導(dǎo)致胞外pH值升高，從而維持了pH 值的相對穩(wěn)定，使細(xì)菌得以存活［7，10］。

從本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中有L-MSG存在的情況下，該菌的生長情況較培養(yǎng)基中無L-MSG的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌生長及耐酸性好，pH值4.0對照組培養(yǎng)基培養(yǎng)的穩(wěn)定期菌液的吸光度是發(fā)酵組菌液吸光度的1.61倍，不同時間對照組和發(fā)酵組菌的存活率值之間有顯著性差異(P＜0.05)，說明對照組菌的耐酸性強(qiáng)。pH 3.5～5.0時，細(xì)菌可以完全利用培養(yǎng)基中添加的L-MSG，在GAD的作用下生成GABA，GABA 的產(chǎn)量分別達(dá) 10.77，11.44，10.94g/L，并使得培養(yǎng)液pH值上升，這說明短乳桿菌NCL912能夠在酸性環(huán)境中生長的原因之一是與GABA的生成有關(guān)。由于GABA的生成，使得細(xì)胞內(nèi)外的pH值維持了平衡，提高了細(xì)菌在低pH值下的生存能力。另外，耐酸性實(shí)驗(yàn)和GAD酶活力實(shí)驗(yàn)表明L-MSG與GAD酶的高表達(dá)有關(guān)，含有L-MSG的培養(yǎng)液的菌的酶活力比不含有L-MSG的培養(yǎng)液的菌的酶活力高，而且有顯著性差異(P＜0.05)。由此可見，該菌的耐酸機(jī)制之一可能是谷氨酸-GABA對向運(yùn)輸機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)研究的短乳桿菌NCL912不僅能高產(chǎn)GABA，而且能在低pH的環(huán)境中生長，并能耐受一定時間(4～6 h)的極端酸性環(huán)境(pH 2.0)，說明該菌能夠在胃腸道的酸性環(huán)境中生存而發(fā)揮有益宿主健康的功效，可以應(yīng)用于食品工業(yè)，具有巨大的市場潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

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The Acid Resistance of Lactobacillus brevis NCL912

Huang Gui-dong1，2，Li Chao-bo1，Cao Yu-sheng1
1(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China)2(Food Bioengineering College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China)

The growth of Lactobaillus brevis NCL912，a γ-aminobutyric acid high-yielding strain，in acid environment and its acid tolerance in extreme acid environment(pH 2.0)were investigated in this paper.Meanwhile，the comparision of the growth，acid resistance，the yield of γ-aminobutyric acid and glutamate decarboxylase activity were determined in the media with and without the addition of L-glutamate sodium(L-MSG).The results showed that Lactobaillus brevis NCL912 could grow at pH ＞3.0，grow well at pH 5.0，and could survive for more than four hours at pH 2.0.The addition of L-MSG can enhance the growth of the strain.L-MSG was converted completely to γ-aminobutyric acid at pH4.0.In addition，the survival percentage(%)and the glutamate decarboxylase activity in the media with and without L-MSG were significantly different(P ＜0.05).The survival percentage(%)and the glutamate decarboxylase activity were better in the media with L-MSG.It was implied that the acid resistance of Lactobaillus brevis NCL912 was related to glutamate-γ-aminobutyric acid antiporter system.

Lactobacillus brevis NCL912，L-glutamate sodium，γ-aminobutyric acid，glutamate decarboxylase

碩士研究生(曹郁生教授為通訊作者)。

2010－05－27，改回日期:2010－11－01