電容法在線活細(xì)胞量傳感器在黑曲霉帶渣發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸中的應(yīng)用*

劉玉偉，黃明志，周勇，張繼學(xué)，楊儒文，馮志菲，常雷，趙親虎

1(國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心(上海)，上海，200237)2(安徽豐原生物化學(xué)股份有限公司，安徽蚌埠，233010)

電容法在線活細(xì)胞量傳感器在黑曲霉帶渣發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸中的應(yīng)用*

劉玉偉1，黃明志1，周勇2，張繼學(xué)2，楊儒文2，馮志菲2，常雷2，趙親虎2

1(國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心(上海)，上海，200237)2(安徽豐原生物化學(xué)股份有限公司，安徽蚌埠，233010)

以黑曲霉帶渣發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的培養(yǎng)過(guò)程為對(duì)象，探討了用電容法在線活細(xì)胞量傳感器測(cè)量復(fù)合培養(yǎng)基中可結(jié)團(tuán)絲狀菌的活細(xì)胞量的可能性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了儀器的最佳分析條件:低通濾波值為60，測(cè)定頻率為雙頻(580，10 085 kHz)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電容法活細(xì)胞量傳感器的電容值與活細(xì)胞量之間有著較好的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)為0.994。在發(fā)酵培養(yǎng)液采用帶渣發(fā)酵的情況下，考察了在線活細(xì)胞電容值與常規(guī)的離線測(cè)定菌濃方法，如細(xì)胞干重、波長(zhǎng)600nm處吸光度OD600和菌體離心體積之間的關(guān)系結(jié)果表明，在0～20 h，各離線參數(shù)與電容值之間的線性相關(guān)系數(shù)最好的僅為0.91。同時(shí)利用在線活細(xì)胞傳感器的電容值能較好地估計(jì)出比生長(zhǎng)速率，比通過(guò)在線間接參數(shù)OUR、CER估計(jì)更準(zhǔn)確。因此，電容傳感器為黑曲酶帶渣發(fā)酵提供了一個(gè)可靠的工具。

在線活細(xì)胞量傳感器，電容值，黑曲霉，復(fù)合培養(yǎng)基，帶渣發(fā)酵

大量活細(xì)胞的存在是生物過(guò)程得以持續(xù)進(jìn)行的前提條件，長(zhǎng)期以來(lái)人們一直試圖檢測(cè)生物過(guò)程中細(xì)胞的濃度，以了解細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，考察細(xì)胞生長(zhǎng)與基質(zhì)消耗及產(chǎn)物形成的關(guān)系。傳統(tǒng)的測(cè)量方法是通過(guò)手工取樣離線測(cè)定，比如測(cè)定干重(DCW)、吸光度(OD600)和離心體積(PMV)等。這些離線測(cè)定方法操作復(fù)雜，滯后時(shí)間長(zhǎng)，測(cè)定結(jié)果是“活”細(xì)胞和“死”細(xì)胞的總和。常用的基于比濁法的細(xì)胞濃度傳感器盡管可在線檢測(cè)細(xì)胞濃度，但也存在諸多不足，如無(wú)法克服培養(yǎng)基中固體成分的干擾，無(wú)法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞，容易受細(xì)胞大小影響等，在實(shí)際應(yīng)用中存在較大誤差。為了解決這些問(wèn)題，近年來(lái)提出了多個(gè)基于不同測(cè)定原理的在線細(xì)胞量測(cè)量方法，如近紅外光譜法［1］、電阻光譜法［2］和電容法是［3］，其中電容法根據(jù)活細(xì)胞具有密閉的細(xì)胞膜系統(tǒng)的特點(diǎn)，在交變電場(chǎng)作用下活細(xì)胞內(nèi)帶電細(xì)胞質(zhì)遷移，使活細(xì)胞成為極化細(xì)胞，形成電容，根據(jù)測(cè)得的電容大小可計(jì)算出活細(xì)胞的量?；陔娙莘ǖ幕罴?xì)胞量測(cè)量已在多個(gè)生物過(guò)程中得到成功應(yīng)用，如酵母菌［4－5］、鏈霉菌［6］和CHO［7］等。檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)物的形成與黑曲霉菌細(xì)胞的生長(zhǎng)密切相關(guān)，活細(xì)胞量的精確測(cè)量非常重要，但由于培養(yǎng)基中水不溶性物質(zhì)的存在，長(zhǎng)期以來(lái)這個(gè)問(wèn)題一直難以解決，尚未見(jiàn)到可在線測(cè)量檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中活細(xì)胞量的報(bào)道。本論文將基于原生質(zhì)電容法的在線活細(xì)胞量傳感器應(yīng)用到檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中，探討帶渣發(fā)酵過(guò)程中活細(xì)胞量的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉(Aspergillus niger)C0827，安徽豐原生化提供。

1.2 培養(yǎng)基和發(fā)酵條件

1.2.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:玉米粉15%，pH值5.8(用Ca(OH)2調(diào)制)。發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉25%，尿素0.02%，pH 5.6～5.8(用Ca(OH)2調(diào))。

1.2.2 培養(yǎng)條件

種子罐培養(yǎng)條件:溫度36℃，通氣量1.2VVM，罐壓0.07 MPa，攪拌轉(zhuǎn)速350 r/min。

發(fā)酵罐培養(yǎng)條件:溫度37℃，通氣量1.1VVM，罐壓0.07 MPa，攪拌轉(zhuǎn)速350 r/min。

1.3 離線參數(shù)分析方法

干重測(cè)量:通過(guò)將40mL的發(fā)酵液用濾紙進(jìn)行過(guò)濾，再用清水清洗2次，直至洗掉發(fā)酵液中的殘?zhí)?，然后將濾紙連同固體一起放到80℃烘箱中烘至恒重。

OD600測(cè)量:通過(guò)發(fā)酵過(guò)程中取得的發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)倍數(shù)稀釋后在波長(zhǎng)600 nm下的吸光值。

PMV測(cè)量:通過(guò)將10mL的發(fā)酵液用10mL離心管離心，測(cè)定離心后固體體積的百分?jǐn)?shù)。

檸檬酸的測(cè)定:用0.142 9mol/L NaOH溶液中和滴定(酚酞指示劑)。

總糖的測(cè)定:采用菲林試劑法。

1.4 在線參數(shù)分析

活細(xì)胞量分析:采用Biomass Monitor 220(Aber，UK)檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中活細(xì)胞濃度。將電極插到30L發(fā)酵罐中，121℃滅菌消毒后，電容和電導(dǎo)可同時(shí)被測(cè)量出來(lái)。該儀器能夠采用多頻率測(cè)量，測(cè)量的電容范圍在0.1～10 MHz，電導(dǎo)范圍為1～100 ms/cm。測(cè)量原理為通過(guò)探頭發(fā)射電脈沖信號(hào)，在探頭周?chē)纬梢粋€(gè)電磁場(chǎng)?；罴?xì)胞有一個(gè)緊湊閉合的細(xì)胞膜，在電磁場(chǎng)下可被看作獨(dú)立的小電容器。在電磁場(chǎng)作用下，活細(xì)胞被極化，細(xì)胞膜周?chē)碾姾缮仙?，這個(gè)電容變化值被準(zhǔn)確檢測(cè)出來(lái)，而死細(xì)胞(細(xì)胞膜破裂)、氣泡、細(xì)胞碎片以及固體培養(yǎng)基顆粒(如玉米粉/黃豆餅粉等)或微載體顆粒等因不能形成密閉的電容，不會(huì)被檢測(cè)到，因此電容電極測(cè)得的信號(hào)值只與發(fā)酵罐中活細(xì)胞量的值有一定的相關(guān)性。

氣體成分分析:發(fā)酵過(guò)程進(jìn)氣和排氣中O2和CO2濃度通過(guò)過(guò)程質(zhì)譜儀MAX-300 LG(Extrel，USA)獲得，將所獲得的在線尾氣數(shù)據(jù)通過(guò)生物過(guò)程軟件“發(fā)酵之星”(華東理工大學(xué))進(jìn)行處理，在線計(jì)算出O2消耗速率OUR，CO2釋放速率CER和呼吸商RQ。

2 結(jié)果和討論

2.1 分析條件優(yōu)化

電容法在線活細(xì)胞傳感器在黑曲霉菌帶渣發(fā)酵過(guò)程的使用還未見(jiàn)報(bào)道，需要考察外部條件對(duì)儀器性能的影響，特別是低通濾波值和測(cè)量頻率對(duì)基線噪聲和漂移性能的影響，以確定儀器的最佳使用條件。按照儀器的使用說(shuō)明，將低通濾波值設(shè)為1，把發(fā)酵罐攪拌和通風(fēng)開(kāi)到最小或關(guān)掉，觀察此時(shí)的電容基線和噪音大小，然后根據(jù)觀察到的基線噪聲，將低通濾波值大小設(shè)定為10，如果信號(hào)噪音強(qiáng)度還是大，那么就需要繼續(xù)增大低通濾波值，直到噪音強(qiáng)度合適。低通濾波值可在1～100之間設(shè)定，過(guò)大和過(guò)小的低通濾波值都不能得到穩(wěn)定的測(cè)量結(jié)果?？紤]到檸檬酸發(fā)酵用培養(yǎng)基的水不溶性物質(zhì)較多以及通風(fēng)量較大，可能會(huì)造成較大的基線噪聲，因此分別把低通濾波值設(shè)為30、45和60，觀察測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)低通濾波值為60時(shí)能取得較好的效果。同時(shí)，測(cè)量頻率設(shè)定為多頻或者低頻，會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。在低通濾波值固定為60的情況下，考察了測(cè)量頻率對(duì)儀器的影響，分別將頻率設(shè)為單頻580 kHz以及雙頻580 kHz和10 085 kHz。單頻測(cè)量時(shí)不考慮背景電容的影響，而雙頻的高頻率測(cè)量值相當(dāng)于培養(yǎng)基的背景電容，儀器能自動(dòng)地從低頻率電容減去高頻率電容。發(fā)酵過(guò)程中儀器在優(yōu)化前(單頻)和優(yōu)化后(雙頻)的測(cè)量曲線如圖1所示。從圖1可看出，用單頻測(cè)量電容曲線上下波動(dòng)幅度較大，無(wú)法正確判斷細(xì)胞的變化情況，而用雙頻測(cè)量的曲線變化平緩，能夠很好地反映發(fā)酵過(guò)程中黑曲霉菌的菌團(tuán)個(gè)體增大的過(guò)程。因此，對(duì)于黑曲霉帶渣發(fā)酵，最優(yōu)的測(cè)定條件為低通濾波值為60，頻率為雙頻580 kHz和10 085 kHz。

圖1 黑曲霉菌帶渣發(fā)酵傳感器最優(yōu)條件

2.2 電容值與活細(xì)胞量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系

要得到活細(xì)胞傳感器測(cè)量出的電容值與活細(xì)胞量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，首先要知道活細(xì)胞量的確切值，但對(duì)于黑曲霉這種在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)結(jié)團(tuán)的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，常用的菌落計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)等方法都不能使用，尚沒(méi)有其他辦法能直接測(cè)出活細(xì)胞的量，為此，本文設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)將玉米粉進(jìn)行液化后過(guò)濾，除去玉米渣，把黑曲霉接種在過(guò)濾清液中進(jìn)行培養(yǎng)，在4～20 h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)分別取樣，離線測(cè)量細(xì)胞干重，結(jié)果如表1所示。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的細(xì)胞活力旺盛，可看作都是活細(xì)胞，而且發(fā)酵液中不含有其他固體顆粒，因此，此時(shí)的細(xì)胞干重大小可直接反映活細(xì)胞量的多少。將離線測(cè)量的細(xì)胞干重與在線檢測(cè)的電容值進(jìn)行線性回歸，得到方程1，其相關(guān)系數(shù)為0.994?？梢?jiàn)在考察的范圍內(nèi)，活細(xì)胞傳感器測(cè)量出的電容值能準(zhǔn)確地反應(yīng)發(fā)酵過(guò)程中活細(xì)胞量的變化。

表1 培養(yǎng)基為過(guò)濾清液時(shí)菌體干重與電容的關(guān)系

2.3 電容值與各種離線測(cè)定值之間的比較

為了探討黑曲霉菌帶渣發(fā)酵中活細(xì)胞量的最佳測(cè)量方法，比較了電容在線測(cè)定法與3種離線測(cè)定方法，結(jié)果如圖2所示。盡管所有的離線測(cè)定方法目前都被廣泛使用，但是它們都各有缺點(diǎn)。OD、PMV、干重(DCW)通常用來(lái)估計(jì)總的菌體濃度，PMV法，因?yàn)樗暮?jiǎn)單易于操作，在醫(yī)藥領(lǐng)域被廣泛用于菌體濃度的測(cè)量，然而培養(yǎng)基配方和細(xì)胞形態(tài)的改變，使這種測(cè)定方法變得不可靠。細(xì)胞干重在一定條件下能很好地反映細(xì)胞量，但在一些發(fā)酵過(guò)程中有的發(fā)酵液組分會(huì)粘附在細(xì)胞表面，即使用去離子水沖洗也不能完全洗掉，導(dǎo)致測(cè)量出的細(xì)胞干重比實(shí)際的細(xì)胞量要大，同時(shí)，檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米渣，取樣時(shí)玉米渣并沒(méi)有完全被菌體利用，因此離線測(cè)定的細(xì)胞干重包含了沒(méi)有被菌體利用的渣子以及死的細(xì)胞。而電容在線測(cè)定法中，電容值只與活細(xì)胞量有關(guān)，與玉米渣的多少?zèng)]有關(guān)系，死的細(xì)胞對(duì)電容值也沒(méi)有影響，是最可靠、最有效的活細(xì)胞量測(cè)定方法。對(duì)各種離線測(cè)定值與在線電容之間的關(guān)系進(jìn)行了擬合，它們都沒(méi)有很好的線性關(guān)系，線性最好的PMV與在線電容間的線性相關(guān)系數(shù)也僅為0.91。如果儀器的穩(wěn)定性不高，每一次測(cè)量的電容結(jié)果有較大差異，則很難解釋發(fā)酵過(guò)程的現(xiàn)象。為此，考察了活細(xì)胞量傳感器在不同批次發(fā)酵過(guò)程中測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性。在相同的菌種、培養(yǎng)基組成及操作條件下，比較了3批發(fā)酵過(guò)程中記錄的電容測(cè)量值，它們之間具有較好的重復(fù)性(見(jiàn)圖2)，因此該傳感器能夠?yàn)楹谇箮гl(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸過(guò)程提供穩(wěn)定可靠的活細(xì)胞量信息。

圖2 在線電容法與各種離線測(cè)定菌濃法的比較

2.4 比生長(zhǎng)速率在線估計(jì)

比生長(zhǎng)速率的控制在發(fā)酵過(guò)程中有著重要的意義，很多種微生物只有在一定的比生長(zhǎng)速率下才能高效生產(chǎn)出特定產(chǎn)物，但由于細(xì)胞量在線測(cè)定技術(shù)的不完善，目前比生長(zhǎng)速率大多根據(jù)離線菌體濃度進(jìn)行計(jì)算，滯后時(shí)間長(zhǎng)，很難實(shí)際應(yīng)用。本文嘗試運(yùn)用在線電容值來(lái)進(jìn)行比生長(zhǎng)速率的在線估計(jì)，比較了其與基于過(guò)程質(zhì)譜儀測(cè)定的尾氣數(shù)據(jù)計(jì)算出的OUR和CER進(jìn)行估計(jì)的方法的優(yōu)劣。

基于電容測(cè)定值的比生長(zhǎng)速率可通過(guò)式(2)計(jì)算:

式中a為菌濃與電容之間的系數(shù)，為常數(shù)，可以消除。將Cap對(duì)t在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)上作圖，直線的斜率即為μ。對(duì)批培養(yǎng)操作在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)上為一曲線，曲線某點(diǎn)的切線斜率即可近似為該點(diǎn)的μ值。同理，生物過(guò)程中OUR、CER和菌量存在一定的關(guān)系，OUR(CER)=X Q，假設(shè)活細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度Q是一樣的，那么OUR、CER和活細(xì)胞量之間也存在正比關(guān)系，比生長(zhǎng)速率分別表示為式(3)和式(4)來(lái)計(jì)算。

在發(fā)酵過(guò)程中，分別基于電容、OUR和CER進(jìn)行估計(jì)的比生長(zhǎng)速率的變化如圖4所示。，總體上來(lái)看，3種估計(jì)方法都能大體上反映出比生長(zhǎng)速率由高到低的變化趨勢(shì)，但從電容值估計(jì)出的比生長(zhǎng)速率值可更真實(shí)地反映菌體的生長(zhǎng)狀態(tài):在20 h之前，發(fā)酵過(guò)程處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，比生長(zhǎng)速率較大且波動(dòng)平緩，20 h后，菌體生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期，比生長(zhǎng)速率維持在零左右。而從過(guò)程質(zhì)譜儀測(cè)定的尾氣數(shù)據(jù)計(jì)算出的OUR和CER進(jìn)行估計(jì)的比生長(zhǎng)速率的值變化較大，究其原因，盡管過(guò)程質(zhì)譜儀分析的精度很高，計(jì)算出的OUR和CER的值的可信度也高，但由于不同代謝狀態(tài)的細(xì)胞可能有著不同的呼吸強(qiáng)度，導(dǎo)致式(3)和式(4)的假設(shè)不能?chē)?yán)格成立，從而引起了估算出來(lái)的比生長(zhǎng)速率值的可信度降低。因此，從在線電容值估計(jì)的比生長(zhǎng)速率可在今后的發(fā)酵過(guò)程在線控制中直接應(yīng)用，可為發(fā)酵過(guò)程提出更精細(xì)的控制策略。

2.5 結(jié)合在線活細(xì)胞量的檸檬酸發(fā)酵過(guò)程參數(shù)分析

圖5顯示了黑曲霉帶渣發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的變化趨勢(shì)，發(fā)酵罐接種后，幾乎沒(méi)有延遲期，很快進(jìn)入了指數(shù)生長(zhǎng)期，菌體利用葡萄糖作碳源，消耗 O2并放出CO2。隨著菌體的生長(zhǎng)，耗氧率增大，CO2釋放率都明顯地同步增加，到了6 h左右兩者變化比較平緩，而后耗氧率保持平穩(wěn)的增大，CO2釋放率卻下降很快，這是因?yàn)椋藭r(shí)菌體生長(zhǎng)過(guò)程中釋放的CO2進(jìn)行羧化形成草酰乙酸進(jìn)而合成檸檬酸，此時(shí)檸檬酸合成較快。16 h后菌體達(dá)到穩(wěn)定期，耗氧率和CO2放率變化不大，都趨于平穩(wěn)，呼吸商也穩(wěn)定。到了54 h以后，菌活力下降，電容值呈下降趨勢(shì)，耗氧率也隨之降低，CO2釋放率增大，導(dǎo)致RQ的陡升。說(shuō)明這時(shí)菌體活力下降，引起耗氧率降低，發(fā)酵過(guò)程中形成的CO2不再進(jìn)行羧化而被大量釋放出來(lái)，造成途徑的變化。與此同時(shí)，隨著菌體的增加，殘?zhí)橇繉⒊氏陆第厔?shì)。產(chǎn)酸在4 h之前變化不大，在細(xì)胞生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定期時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行羧化，酸度增加速率大。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，在線電容值很好地描述了活細(xì)胞量的變化，為菌體生長(zhǎng)控制和產(chǎn)物合成優(yōu)化提供了條件。

圖3 用電容法、OUR和CER估計(jì)的比生長(zhǎng)速率

圖4 黑曲霉發(fā)酵過(guò)程各種參數(shù)的變化

3 結(jié)論

本文以黑曲霉帶渣發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的培養(yǎng)過(guò)程為對(duì)象，探討了用電容法在線活細(xì)胞量傳感器來(lái)解決這個(gè)難題的可能性。通過(guò)對(duì)儀器的分析條件進(jìn)行優(yōu)化，使其能夠不受培養(yǎng)基中水不溶性物質(zhì)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電容法活細(xì)胞量傳感器的電容值與活細(xì)胞量之間有著較好的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系，在相同實(shí)驗(yàn)條件下數(shù)據(jù)的重復(fù)性較好。在比生長(zhǎng)速率的估計(jì)中，在線電容法能準(zhǔn)確地描述細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的變化。綜上所述，電容法在線活細(xì)胞量傳感器能夠準(zhǔn)確測(cè)量出復(fù)合培養(yǎng)基中黑曲霉等可結(jié)團(tuán)絲狀菌活細(xì)胞量，了解這類(lèi)菌體的細(xì)胞生長(zhǎng)代謝情況，從而為對(duì)其實(shí)施控制提供了較好的檢測(cè)手段。

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Study on Online Capacitance Viable-Cell Mass Monitoring in Citric Acid Fermentation by Aspergillus niger in Complex Medium with Corn Dregs

Liu Yu-wei1，Huang Ming-zhi1，Zhou Yong2，Zhang Ji-xue2，Yang Ru-wen2，F(xiàn)eng Zhi-fei2，Chang Lei2，Zhao Qin-hu2
1(National Engineering Research Center for Biotechnology(Shanghai)，Shanghai 200237，China)2(Anhui BBCA Biochemical Co.Ltd，Bengbu 233010，China)

In this paper，cultivations of Aspergillus niger grown on an complex medium with corn dregs were performed.The feasibility of measuring online capacitance viable-cell mass of Fila-fungus grown on a complex medium was discussed.This study confirmed that the best measurement conditions were doubled frequency of 580 kHZ，10085 kHZ and low pass filter of 60.The result proved the relationship between capacitance and viable-cell mass with a correlation coefficient(R2)of 0.993 8.While complex medium with corn dregs was adopted，conventional off-line biomass determinations of several parameters，including DCW，optical density at 600nm wavelength(OD600)，packed mycelial volume(PMV)were performed throughout the bioprocess and then compared with on-line viable-cell concentrations measured using a capacitance probe.As a result，the best correlation coefficient(R2)is 0.907 2.During the same time frame，we compared the results determined by on-line indirect estimation methods including oxygen uptake rate(OUR)and carbon dioxide evolution rate(CER)，and reached at the conclusion that the specific growth rates estimated by on-line capacitance measurement could be more reliable during citric acid fermentation.Therefore，it is concluded that a capacitance probe is a practical tool for real-time viable biomass monitoring in a complex medium with corn dregs.

on-line viable-cell mass sensor，capacitance，Aspergillus niger，complex medium，corn dregs

碩士。

*國(guó)家“863”項(xiàng)目(2006AA02Z204)

2010－05－26，改回日期:2010－08－18