轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)乳蛋白對(duì)新鮮干酪特性的影響

盧曉明,王培根,任發(fā)政,陳尚武

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué),食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,教育部、北京市功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)乳蛋白對(duì)新鮮干酪特性的影響

盧曉明,王培根,任發(fā)政,陳尚武＊

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué),食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,教育部、北京市功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)交聯(lián)酪蛋白,研究其對(duì)新鮮干酪凝乳的成分和質(zhì)構(gòu)特征的影響。結(jié)果表明,TG能夠加速凝乳發(fā)酵過程,提高乳中蛋白質(zhì)和脂肪的回收率,并顯著降低了乳清中的蛋白含量,對(duì)凝乳的質(zhì)構(gòu)特征也具有明顯修飾作用。但與凝乳酶同時(shí)作用時(shí),TG酶對(duì)凝乳的修飾作用不顯著。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG),凝乳酶,干酪,質(zhì)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮牛奶 北京三元有限公司;酪蛋白 Sigma; TG酶 日本味之素公司;發(fā)酵劑、凝乳酶 丹尼斯克北京公司;其它試劑 均為分析純。

DK-8B電熱恒溫水槽、DNP型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DYY-12型電腦三恒多用電泳儀 北京市六一儀器廠;干酪模具 自制;質(zhì)構(gòu)儀 T MS-PRO,美國;pH211精密酸度計(jì) 意大利哈納科儀公司; KDY-9830凱氏定氮儀 北京市恩貝特機(jī)電技術(shù)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TG對(duì)乳蛋白的交聯(lián)處理 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(活力 100U/g)用蒸餾水溶解,制成 0.1g/mL酶溶液;酪蛋白用 8mol/L尿素溶解。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)處理溫度為 37℃,交聯(lián)酶活為 0.6U/g蛋白,交聯(lián)時(shí)間為0～8h,每 1h為間隔。

1.2.2 干酪制作 新鮮牛奶分為四組,酸凝對(duì)照組、TG處理組、凝乳酶處理組和 TG與凝乳酶共同作用組,分別記作 CL、TG、RN和 TR。各組牛奶在 63℃, 30min巴氏殺菌,冷卻到 32℃。添加直投式發(fā)酵劑,主要成分為 Lactococcus lactis subsp.lactis和 L.lactis subsp.Crem oris。在 32℃發(fā)酵 2h后,分別在 TG和 RN組添加 TG酶 (0.6U/g)和凝乳酶 (0.2mL/L),TR組則同時(shí)添加 TG和凝乳酶。pH4.6時(shí)切割,拍乳清,裝模成型。

1.2.3 干酪理化參數(shù)分析 干酪和乳清中蛋白含量采用凱氏定氮法測(cè)定,蛋白系數(shù)為 6.38;干酪脂肪采用有機(jī)溶劑提取法(王志清,1983);水分含量測(cè)定采用烘箱干燥法。

1.2.4 發(fā)酵速率測(cè)定 各組樣品加入發(fā)酵劑后于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi) 32℃發(fā)酵,每 0.5h用酸度計(jì)測(cè)各組凝乳的 pH,不重復(fù)取樣,樣品重復(fù)三次。

1.2.5 干酪質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定 采用質(zhì)構(gòu)儀在室溫(20±2℃)進(jìn)行測(cè)定,樣品形狀為高度 10mm直徑10mm的圓柱體,用取樣器從干酪中心部位取樣,在室溫下放置 30min。使用直徑 25mm的圓柱形探頭,進(jìn)行兩次循環(huán)垂直壓縮,壓縮速率為 60mm/min,壓縮變形為 50%。質(zhì)構(gòu)特征曲線如圖 1所示?？梢詼y(cè)得干酪的硬度、彈性、內(nèi)聚性和粘著性,以及由此計(jì)算出的膠粘性和咀嚼性。每組樣品重復(fù)六個(gè)試樣。

圖 1 兩次垂直壓縮循環(huán)質(zhì)構(gòu)特征曲線

1.2.6 SDS-PAGE電泳 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)采用垂直電泳儀進(jìn)行。濃縮膠濃度為4%,用 125mmol/L pH6.8的 Tris-HCl緩沖液配制,分離膠濃度為 15%,用 380mmol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液配制,含 0.1%(w/v)SDS。濃縮膠電壓 90V,分離膠電壓 110V。用考馬斯亮藍(lán) R250染色,甲醇和醋酸混合液脫色。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用 SPSS16.0軟件 (SPSS Inc.,美國)的一般線性模型進(jìn)行方差分析。鄧肯氏多重檢驗(yàn)確定數(shù)據(jù)間的差異,顯著水平為 P≤0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 TG酶對(duì)酪蛋白的交聯(lián)作用

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)酪蛋白交聯(lián)作用的 SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖 2所示,37℃時(shí) 8h內(nèi),TG對(duì)酪蛋白具有明顯的交聯(lián)作用,作用 1h后κ-酪蛋白條帶明顯減弱,2h以后出現(xiàn)了清晰的大分子聚合物條帶,α-和β-酪蛋白條帶也逐漸減弱,說明已經(jīng)形成了分子間或分子內(nèi)的交聯(lián)作用。由于κ-酪蛋白位于酪蛋白的外層,這種交聯(lián)也首先從κ-酪蛋白開始進(jìn)行。干酪從開始到排乳清的時(shí)間一般為 2～8h,因此,在干酪制作過程中,能夠通過添加 TG酶使酪蛋白發(fā)生交聯(lián),從而影響其凝乳過程。

圖 2 TG酶在 37℃下對(duì)酪蛋白作用0～8h的 SDS-PAGE電泳條帶

2.2 TG酶對(duì)凝乳發(fā)酵速率的影響

各組凝乳發(fā)酵速率如圖 3所示,對(duì)照組 (CL)僅為乳酸菌發(fā)酵,發(fā)酵速率緩慢,顯著低于其它三組,添加 TG酶能夠明顯提高發(fā)酵速率,表明酪蛋白交聯(lián)作用更利于乳酸菌發(fā)酵,但其低于凝乳酶作用的凝乳,凝乳酶水解酪蛋白暴露出疏水基團(tuán),使酪蛋白凝聚加速了發(fā)酵過程。TG和凝乳酶同時(shí)作用的凝乳其發(fā)酵速率與凝乳酶單獨(dú)作用時(shí)無顯著性差異(P>0.05),可以表明當(dāng) TG和凝乳酶同時(shí)作用時(shí),凝乳酶處于優(yōu)勢(shì),對(duì)酪蛋白的水解作用一定程度上抑制了 TG對(duì)酪蛋白的交聯(lián)作用。

圖 3 TG和凝乳酶添加對(duì)凝乳發(fā)酵速率的影響

2.3 TG和凝乳酶對(duì)干酪化學(xué)指標(biāo)的影響

各組處理制得干酪的化學(xué)指標(biāo)如圖 4所示,凝乳酶處理的凝乳水分含量顯著低于其它各組,脂肪和蛋白含量顯著高于其它各組(P≤0.05)。添加 TG酶和同時(shí)添加 TG、凝乳酶對(duì)干酪的脂肪、蛋白含量沒有明顯提高,但提高了干酪的水分含量,TG酶對(duì)酪蛋白的交聯(lián)增加了凝乳的持水性,Faergemand和Qvist(1997)也在研究中表明,酪蛋白交聯(lián)能夠增強(qiáng)酸凝形成的凝膠的乳清結(jié)合性能。TG酶單獨(dú)處理能夠增加凝乳干物質(zhì)中的蛋白含量,說明蛋白質(zhì)的回收率得到了提高,與對(duì)照組和凝乳酶單獨(dú)處理組比較,干物質(zhì)中的脂肪含量也得到了提高。由圖 5可知,TG酶處理的干酪乳清中蛋白含量顯著低于其它各組(P≤0.05),表明 TG酶處理能夠減少乳清蛋白在干酪制作中的損失,可能由于酪蛋白的交聯(lián)作用形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使一部分乳清蛋白保留在凝乳中,也可能是乳清蛋白本身在 TG作用下與酪蛋白發(fā)生了交聯(lián)。但 TG和凝乳酶共同作用并不能降低乳清蛋白的排出,反而在一定程度上增加了乳清蛋白的損失,可以認(rèn)為在凝乳酶存在條件下,TG酶不能產(chǎn)生很好的交聯(lián)效果,因此也不能獲得較好的乳清結(jié)合性能以及乳清蛋白的存留。

圖 4 TG酶和凝乳酶處理的新鮮干酪蛋白、脂肪、水分及干物質(zhì)中脂肪和蛋白含量

圖 5 TG和凝乳酶處理對(duì)乳清中蛋白含量的影響

2.4 TG和凝乳酶處理對(duì)新鮮干酪質(zhì)構(gòu)的影響

TG酶作用的凝乳在硬度、膠黏性、咀嚼性和粘著性上顯著低于對(duì)照組凝乳(圖 6),這可能與其水分含量較高有關(guān)。有研究表明,凝乳硬度隨水分含量升高而降低 (Everard et al,2006;Bhaskaracharya& Shah,1999),膠粘性 =硬度 ×內(nèi)聚性,硬度降低直接導(dǎo)致膠粘性降低。凝乳酶單獨(dú)處理獲得的干酪在硬度、膠粘性和粘著性上與對(duì)照組無顯著性差異,只是咀嚼性低于對(duì)照組,咀嚼性 =硬度 ×內(nèi)聚性 ×彈性,咀嚼性隨彈性而降低,而彈性的降低可能是由于其較低的水分含量。TG酶和凝乳酶同時(shí)作用時(shí),凝乳硬度、膠黏性和咀嚼性均為四組中最低,這可能是由于 TG對(duì)蛋白質(zhì)起到交聯(lián)作用,而凝乳酶是將酪蛋白水解,兩者共同作用下,蛋白質(zhì)不能形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),因此質(zhì)構(gòu)參數(shù)下降。圖 7為各組凝乳的內(nèi)聚性和彈性,有研究表明,蛋白和脂肪含量對(duì)內(nèi)聚性影響較大,而水分含量對(duì)內(nèi)聚性則沒有顯著影響(Bhaskaracharya&Shah,1999),蛋白和水分對(duì)彈性具有重要影響 (Bhaskaracharya&Shah,1999)。TG酶作用的凝乳內(nèi)聚性和彈性在四組中最高,可能由于酪蛋白的交聯(lián)作用使得蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較緊湊致密,而其較高的水分含量也是彈性特征明顯的原因。但 TG和凝乳酶同時(shí)作用與凝乳蛋白作用比較,內(nèi)聚性和彈性沒有顯著性差異,均低于對(duì)照組,再次表明在凝乳酶存在條件下,TG酶對(duì)酪蛋白的交聯(lián)作用不明顯,在質(zhì)構(gòu)特征上不具有明顯的修飾作用。

圖 6 TG和凝乳酶處理的新鮮干酪硬度、膠粘性、咀嚼性和粘著性變化

圖 7 TG和凝乳酶處理的新鮮干酪內(nèi)聚性和彈性變化

3 結(jié)論

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)酪蛋白的交聯(lián)作用對(duì)于新鮮干酪的化學(xué)成分和質(zhì)構(gòu)有顯著影響。TG在 37℃2h即對(duì)酪蛋白產(chǎn)生明顯的交聯(lián)作用,產(chǎn)生大分子聚合物,交聯(lián)作用首先發(fā)生在位于酪蛋白表層的κ-酪蛋白。TG酶作用能夠加速凝乳發(fā)酵過程,提高乳中蛋白質(zhì)和脂肪的回收率,同時(shí)能夠增加乳清結(jié)合能力,降低乳清中的蛋白含量,提高乳清蛋白的利用率。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的新鮮凝乳硬度、膠粘性和粘著性較低,但增加了凝乳的內(nèi)聚性和彈性,這與其修飾后凝乳的化學(xué)成分變化有關(guān)。但在凝乳酶作用下,TG對(duì)酪蛋白的交聯(lián)作用不明顯,對(duì)凝乳成分和質(zhì)構(gòu)的修飾程度不顯著。

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Effectoftransglutaminaseproteincross-linking onthecharateroffreshcheese

LUXiao-ming,WANGPei-gen,RENFa-zheng,CHENShang-wu＊
(KeyLaboratoryofFunctionDairyMinistryofEducationandBeijingCity,CollegeofFoodScience andNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China)

Using transglutaminase(TG)tocross-link thecasein,theeffecton thecomposition and textural characterizeofresultedcheeseswasstudied.TheresultsindicatedthatTGpromotedthefermentationprocessand increasedtherecoveryofproteinandfat.TheproteininwheydecreasedsignificantlywithTGtreated.TheTGhad importanteffecton the texturalpropertiesofresulted cheese.Buttherewasminorinfluence ofTG on the compositionandtexturalpropertieswhenrennetpresented.

transglutaminase;rennet;cheese;texture

TS252.53

A

1002-0306(2010)01-0179-04

在干酪生產(chǎn)過程中,干酪凝膠的形成是至關(guān)重要的,而凝乳酶的利用則是干酪生產(chǎn)中的一個(gè)基本步驟。一般來講,通過添加凝乳酶使酪蛋白膠束形成凝膠的機(jī)制主要有三個(gè)階段:在第一階段中,凝乳酶水解 80%～90%的κ-酪蛋白分子;酪蛋白膠束形成副酪蛋白膠束,分子間斥力降低,疏水作用加強(qiáng),有利于絮凝的發(fā)生;副κ-酪蛋白膠束聚合在一起,形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),乳清析出。凝膠的表現(xiàn)形態(tài)、質(zhì)構(gòu)特性對(duì)干酪奶的感官和功能品質(zhì)都有重要影響,凝乳的形成受許多因素的影響,如 pH、鈣離子濃度、乳的熱處理方式等 (B?nisch,2008)。同時(shí)分子間疏水基、離子鍵、共價(jià)鍵等對(duì)于蛋白質(zhì)凝膠體系的形成發(fā)揮著重要的作用,改變共價(jià)鍵的數(shù)目和強(qiáng)度都會(huì)使蛋白質(zhì)的凝膠性能發(fā)生轉(zhuǎn)變,而轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)酪蛋白的交聯(lián)作用也能夠引起凝乳的變化。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)是一種?；D(zhuǎn)移酶,能夠?qū)⑾嗤虿煌鞍踪|(zhì)分子殘基的谷氨酸和賴氨酸進(jìn)行交聯(lián),形成分子間的或分子內(nèi)的交聯(lián)與聚合,形成新的共價(jià)鍵(Kashiwagietal,2002)。而在乳蛋白中酪蛋白具有TG酶作用的良好底物特征。κ-酪蛋白分子位于酪蛋白膠束的表面,其中有四個(gè)谷氨酸殘基能夠作為潛在的交聯(lián)位點(diǎn),從而使κ-酪蛋白能夠被 TG酶交聯(lián)(Sharmaetal,2001)。TG對(duì)食品蛋白的交聯(lián)存在著廣泛的作用,如酪蛋白、大豆分離蛋白、谷朊蛋白、乳清蛋白等都可以作為 TG作用的底物。TG酶可直接對(duì)蛋白質(zhì)凝膠膠束表面蛋白進(jìn)行交聯(lián),還可將膠束間蛋白進(jìn)行交聯(lián)。已經(jīng)有研究表明,通過 TG酶交聯(lián)酪蛋白能夠達(dá)到對(duì)產(chǎn)物質(zhì)構(gòu)的高度修飾(DeJong, 2002;Jarosetal,2006)。TG交聯(lián)乳蛋白的研究較多,但將 TG用于酶凝新鮮干酪的研究并不多見。本文研究 TG和凝乳酶用于新鮮干酪的作用比較,旨在研究 TG交聯(lián)和凝乳酶的相互作用對(duì)新鮮干酪理化指標(biāo)、凝乳特征、產(chǎn)率以及質(zhì)構(gòu)特性的影響。

2009-03-31 ＊通訊聯(lián)系人

盧曉明(1982-),女,博士研究生,研究方向:乳蛋白結(jié)構(gòu)與干酪加工技術(shù)。

科技部十一五支撐計(jì)劃(2006BAD04A06)。